光谱法研究替硝唑与牛血清白蛋白的相互作用

刘 里,成飞翔,王开燕

(曲靖师范学院化学与环境科学学院，中国 曲靖 655011)



光谱法研究替硝唑与牛血清白蛋白的相互作用

刘 里*,成飞翔,王开燕

(曲靖师范学院化学与环境科学学院，中国 曲靖 655011)

通过各种光谱方法研究替硝唑(TNZ)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.用Stern-Volmer， Lineweaver-Burk和双对数方程计算了速率常数(Kq)，猝灭常数 (Ksv)，静态荧光猝灭缔合常数(KLB)，结合常数 (Kb)和结合位点数(n).结果表明：TNZ能结合BSA.由于生成TNZ-BSA复合物，TNZ对BSA的猝灭是静态猝灭机理.热力学参数表明是一个自发过程，其作用力类型主要为疏水作用力.有一个结合位点.BSA 的亚螺旋域ⅢA是主要结合位置，离酪氨酸残基更近.有弱的负协同作用.TNZ对BSA构象几乎不产生影响，Mg2+，Co2+，Fe3+，Ni2+，Mn2+和Cr3+对TNZ与BSA结合产生促进作用，延长药效时间.该实验对揭示药物动力学问题及后续硝基咪唑类药物的研发提供了理论依据.

替硝唑；牛血清白蛋白；相互作用；金属离子；光谱法

人类生活离不开药物.人体内的血浆蛋白(主要是血清白蛋白)不同程度地与进入血液的药物分子结合后，随着血液循环分布于全身.所以，药物在生物体内的吸收、代谢等受血清白蛋白与药物的结合程度的直接影响.替硝唑(TNZ)是新一代硝基咪唑类抗厌氧菌药，疗效高、疗程短、副作用小，具有吸收迅速、完全和生物利用度高的优点[1]，是一种非处方的常用抗生素.牛血清白蛋白(BSA)是血液中最丰富的运载蛋白之一.近年来，由于BSA的价格低廉，易于获得和非常好的的配体结合性质，BSA常被选作目标蛋白分子模型[2-4].而且由于在氨基酸序列及结构方面与人血清白蛋白(HSA)极其相似，BSA在药物研究中应用十分广泛[3-5].到目前为止，替硝唑与BSA的相互作用还未见报道.本文通过使用荧光光谱和紫外光谱，在不同温度下详细研究了两者的相互作用.用同步荧光光谱研究了替硝唑与BSA的相互作用强度和结合模式.计算了3个温度下替硝唑与BSA相互作用的热力学常数、猝灭常数、速率常数、结合位点数等参数，探讨了替硝唑与BSA结合对蛋白质构象的影响、药物的协同作用、作用类型、金属离子对相互作用的影响以及结合位置等.这些研究旨在为探讨硝基咪唑类药物的药用机理提供信息，对该类药物的临床医学研究有一定意义.

1 实验

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光光谱仪(日本日立公司)， Cary 50型紫外-可见光谱仪(美国瓦里安技术中国有限公司)， HWS12型超级恒温水浴(上海一恒科技有限公司) ，pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司).牛血清白蛋白(北京奥博星生物技术公司) ，替硝唑 (98%，森贝伽(南京)生物有限公司)，放入冰箱4 ℃保存，现用现配.其它试剂为分析纯，用水为超纯水.

1.2 实验方法

依次加入0.50 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL，0.10 mol·L-1，pH=7.40的Tris-HCl缓冲溶液1.0 mL，1.0×10-5mol/L的BSA 1.0 mL，不同体积1.617 6×10-3mol·L-1替硝唑溶液，于10 mL比色管中定容.分别在299，309，319 K温度下，以最大激发和发射波长(λex/λem)，扫描荧光光谱和同步荧光光谱，记录加入替硝唑前后的荧光强度F0和F.按照上述条件，扫描体系的吸收光谱.在TNZ-BSA体系中加入金属离子(终浓度1×10-5mol·L-1)，测其荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 猝灭光谱

图1为TNZ-BSA体系的荧光发射光谱图，当以280 nm激发时，TNZ本身在300～450 nm范围内无发射峰. BSA的λex/λem为280 nm/345 nm.当替硝唑加入BSA溶液后，λem红移到373 nm.随着替硝唑浓度的增加，F逐渐减小，表明替硝唑对BSA的荧光有猝灭，发生了相互作用.

2.2 猝灭机理分析

药物与蛋白的结合主要用两种猝灭类型描述：静态猝灭和动态猝灭[6].动态猝灭与扩散有关，温度升高时溶液的黏度下降，同时分子的运动加速，其结果使分子的扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数Ksv.静态猝灭是指荧光分子与猝灭剂之间形成不发光的基态配合物.温度升高可能引起药物-蛋白质缔合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的程度[7].替硝唑对BSA的猝灭过程遵循Stern-Volmer方程[7]：F0/F=1+Kqτ0[TNZ]=1+Ksv[TNZ]，式中τ0为荧光寿命(10-8s数量级左右[6-8])，[TNZ]为替硝唑浓度，Kq为速率常数.在299，309，319 K温度下绘制Stern-Volmer曲线(图2)，并计算相关参数列于表1中.最大动态猝灭速率常数为2.0×1010L·mol-1·s-1[7]，比TNZ-BSA的Kq小两个数量级，推测替硝唑对BSA的猝灭非动态猝灭.温度越高，Ksv越小，表明TNZ对BSA荧光的猝灭过程遵循静态猝灭机理.

注：1→9:[BSA]=1.0×10-6mol·L-1, [TNZ]=(0,1.296,1.620,1.944,2.268,2.916,3.240,3.564,3.888)×10-4mol·L-1; 10: [TNZ]=1.296×10-4mol·L-1.图1 TNZ-BSA的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of TNZ-BSA

图2 不同温度下TNZ对BSA的Stern-Volmer曲线Fig.2 Stern-Volmer plots of TNZ vs. BSA at different temperatures

温度T/KStern⁃Volmer方程Ksv/(L·mol-1)Kq/(L·mol-1·s-1)相关系数r299F0/F=29240[TNZ]-0．7847292402．9240×10120．9993309F0/F=29104[TNZ]-1．4403291042．9104×10120．9960319F0/F=25311[TNZ]-0．8023253112．5311×10120．9976

动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质吸收光谱[8].相反，静态猝灭过程中基态配合物的生成往往引起荧光物质吸收光谱的改变[8].因此，研究TNZ-BSA体系的紫外光谱也可以判定猝灭机理.对比图3中曲线1(TNZ)、曲线2(BSA)和曲线(3～10)(TNZ-BSA)可知，随着替硝唑不断加入BSA溶液后，吸收强度和峰形与峰位(320 nm移到315 nm)都发生了改变，表明推断TNZ对BSA静态猝灭过程是合理的.

静态荧光猝灭缔合常数KLB常用Lineweaver-Burk方程[9]来计算： (F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[TNZ])-1.以(F0-F)-1为纵坐标，以[TNZ]-1为横坐标，绘制曲线，并计算KLB值(表2). 3个温度下KLB值都为104数量级，表明替硝唑与BSA形成的缔合物稳定性好.温度越高，TNZ-BSA缔合物稳定性下降，KLB越小，与静态猝灭机理相符.

表2 Lineweaver-Burk方程

2.3 结合位点n及结合常数

药物小分子与BSA大分子的结合位点n和表观结合常数Kb，常用双对数方程lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[TNZ][8-10]计算而得.以lg(F0-F)/F为纵坐标，以lg[TNZ]为横坐标，作图4，并计算相关参数列于表3.由表3可知，当温度低于309 K时，Kb和n随温度的增加而增加，n约等于1，可形成一个结合位点；当温度高于309 K时，Kb和n随温度的增加而减小，n约等于1，可形成一个结合位点；在309 K时Kb和n达到最大值，n约等于2，可形成两个结合位点.总之，BSA对TNZ的结合易受温度控制，高温不利于TNZ被BSA转运和储存.

表3 双对数方程

注：1: [TNZ]=1.296×10-4mol·L-1,2～10: [BSA]=1.0×10-6mol·L-1, [TNZ]=(0，1.296，1.620，1.944，2.268，2.916，3.240，3.564，3.888) ×10-4mol·L-1.图3 TNZ (1)和BSA(2),TNZ-BSA(3～10)紫外吸收光谱Fig.3 UV adsorption spectra of TNZ(1),BSA(2) and TNZ-BSA(3～10) slutions

图4 不同温度下 lg[(F0-F)/F]与 lg [TNZ]关系曲线Fig.4 lg[(F0-F)/F] vs. lg [TNZ] plots at different temperatures

2.4 作用力类型

根据热力学方程[8-10]算出反应体系的熵变ΔS、焓变ΔH和吉布斯自由能变ΔG，见表4.由表4可知，ΔG<0，ΔH>0，ΔS>0表明TNZ与BSA结合为自发进行的放热反应，疏水作用力起主要作用.

表4 热力学常数和nH值

图5 λex=280 nm/295 nm 时，TNZ-BSA荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of TNZ-BSA at λex=280 nm/295 nm ([TNZ]=1.296×10-4～4.212×10-4mol·L-1)

2.5 结合部位的确定

由二硫键连接起来的几个螺旋状区域构成了BSA分子的一级结构.BSA 分子的二级结构包括3个ɑ-螺旋域(Ⅰ～Ⅲ)， 其中每个ɑ-螺旋域又分A和 B 两个亚结构域.BSA与药物的结合具有特异性.药物在BSA 上的结合部位主要在 3个位点(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ).其中位点Ⅰ和位点Ⅱ分别位于亚螺旋域ⅡA和ⅢA 的疏水腔中，而位点Ⅲ位于亚域ⅢA[13].按照Sulkowska A小组的研究方法[14-16]，以F/F0对[TNZ]/[BSA]做图5，λex=280 nm/295 nm 的BSA-TNZ光谱曲线没有重叠或交叉在一起.而且λex=295 nm的F/F0明显比λex=280 nm的小，表明替硝唑与BSA的结合位置主要在亚螺旋域ⅢA中.

2.6 药物协同性

药物的协同作用常用Hill方程[13-15]进行分析：lgS(Sm-S) =lgK+nHlg[TNZ]，式中nH为Hill系数，K为结合常数，S为饱和分数，S=(F0-F)/F0，1/Sm为截距.1/S对1/[TNZ]作图.由表4可知，3个温度下nH值都略小于1，表明TNZ有微弱的负协同性.先结合到BSA位点上的药物分子，会阻碍后继药物分子与蛋白质的结合；nH值随温度增大而增加，表明温度越高，结合到位点上越困难.这种负协同作用可能是由药物的分子结构决定的，TNZ浓度加大导致后续TNZ对 BSA 的亲和性降低.

2.7 同步荧光研究TNZ对BSA构象的影响

同步荧光光谱被用来研究蛋白质构象的改变.对于蛋白质的同步荧光光谱，当Δλ=15 nm/60 nm时，表征酪氨酸/色氨酸残基的特征信息.由图6可见，增大替硝唑的浓度，酪氨酸残基的λem红移了4 nm，而色氨酸残基的λem没有改变.表明加入替硝唑后，蛋白质的构象没有发生改变.图6(A)中，替硝唑猝灭络氨酸残基荧光强度的程度大于图6(B)中色氨酸残基的，表明替硝唑与蛋白质结合位点偏向于酪氨酸残基.

注：[BSA]:1.0×10-6mol·L-1; from 1 to 10: [TNZ]=(0，1.296，1.620，1.944，2.268，2.916，3.240，3.564，3.888，4.212) ×10-4mol·L-1图6 BSA-TNZ的同步荧光光谱图Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BSA-TNZ

2.8 金属离子的影响

生命活动中体内金属离子的存在会直接影响药物与蛋白质的结合[10-12].研究MgSO4,CoCl2, Ni(NO3)2,FeCl3,CrCl3和MnCl2对BSA与替硝唑的结合作用的影响，实验结果见表5.由表5可知，加入6种金属离子后，结合常数n和结合常数Kb′都有不同程度的增加，其中Ni2+的加入对体系影响最大，表明这5种金属离子对药物与白蛋白的结合产生了促进作用，有利于延长药物的释放时间，延长了药效时间.原因可能是金属离子先与替硝唑结合，然后与BSA结合，金属离子促进了TNZ与BSA的结合；或是金属离子通过架桥作用或形成“离子架桥”[10-12]方式参与其中，所以有助于TNZ对BSA的荧光猝灭.

表5 金属离子对TNZ-BSA体系的影响

3 结论

替硝唑与BSA的相互作用是静态猝灭过程.通过氢键和范德华力相结合，形成1个结合位点.结合位置在BSA的亚螺旋域ⅢA中，靠近酪氨酸残基.有微弱的药物负协同作用.替硝唑的加入几乎不影响BSA的构象改变.金属离子的加入对TNZ与BSA结合产生促进作用，延长药效时间.这些重要信息为后续硝基咪唑类药物的研发和进一步探讨替硝唑在生物体内与蛋白质的作用机制和生物学效应提供了理论依据.

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(编辑 WJ)

Study on the Interaction of Tinidazole with Bovine Serum Albumin by Spectroscopic Methods

LIULi*,CHENGFei-xiang,WANGKai-yan

(College of Chemistry and Environmental Science, Qujing Normal University, Qujing 655011, China)

The interactions of Tinidazole (TNZ) with bovine serum albumin (BSA) were investigated by various spectroscopic methods in this work. The rate constant (Kq), quenching constant (Ksv), static fluorescence quenching association constant (KLB)，binding constant (Kb) and binding site number (n) were calculated using Stern-Volmer, Lineweaver-Burk and double logarithm equations. The results from this study show that TNZ is able to bind with BSA. The probable quenching mechanism of BSA by TNZ is mainly the static quenching due to the formation of a TNZ-BSA complex. Our results of thermodynamic parameters indicate that the electrostatic force plays the main role in the binding process, which appears to be spontaneous. The obtained data for binding sites ofnapproximately equal to 1 indicates that there is a single class of binding site for the BSA with TNZ. The primary binding site of TNZ is located at the sub-domain ⅢA of BSA close to the tyrosine residue. There exists some weakly negative cooperative effect. The conjugation reaction would hardly affect the conformation of BSA. Mg2+， Co2+， Fe3+， Ni2+， Mn2+and Cr3+promote the interaction of TNZ with BSA and prolong the drug effect time. This study provides a theoretical basis for the revelation of its pharmacokinetics as well as starting point for the further development of new nitroimidazoles drugs.

tinidazole; bovine serum albumin; interaction; metal ions; spectroscopic methods

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.010

2015-09-13

国家自然科学基金资助项目(21261019)；云南省教育厅科研基金项目(2015C090Y)

O657.31; R285

A

1000-2537(2016)06-0055-06

*通讯作者,E-mail：m18908746298@163.com