滋阴明目丸对大鼠视网膜光损伤后细胞凋亡的影响

胡敏娜，罗萍，颜家朝，李传课，李波，龙达

·论著：实验研究·

滋阴明目丸对大鼠视网膜光损伤后细胞凋亡的影响

胡敏娜1，罗萍2，颜家朝2，李传课2，李波2，龙达2

目的观察滋阴明目丸对Sprague-Dawley（SD）大鼠视网膜光损伤后视细胞凋亡的影响。方法SD大鼠60只，采用随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、滋阴明目丸低剂量组、滋阴明目丸中剂量组、滋阴明目丸高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余5组大鼠均建立视网膜光损伤模型，光损伤处理后3 d开始灌胃给药。滋阴明目丸低、中、高剂量组予滋阴明目丸，剂量分别相当于成人1/3倍（2.6 g/kg，0.052g/ml）、成人等效剂量（7.8 g/kg，0.156 g/ml）、成人3倍剂量（23.4 g/kg，0.46 g/ml），阳性对照组予杞菊地黄丸成人等效剂量（1.62 g/kg，0.081 g/ml），空白对照组及模型对照组予生理盐水。各组给药15 d后处死，制作视网膜石蜡切片，TUNEL染色，光学显微镜观察计算视细胞凋亡指数（AI）。结果空白对照组的AI值为1.5439%±1.5154%，模型对照组AI值远高于空白对照组（P＜0.01），为63.3077%±4.7531%。低剂量组AI值60.8298±5.9315%，与模型对照组数值接近（P=0.095）；中、高剂量组及阳性对照组AI值明显低于模型对照组（P值均＜0.01），数值分别23.2864%±7.0224%，22.5674%±5.8763%，23.0666%±5.5213%，该三组间两两比较，差异均无统计学意义（中剂量组与高剂量组比较，P=0.639；中剂量组与阳性对照组比较，P=0.886；高剂量组与阳性对照组比较，P=0.733）。结论一定剂量的滋阴明目丸可以抑制光损伤模型大鼠的视细胞凋亡，对光损伤后大鼠的视细胞具有一定的保护作用。

细胞凋亡；视网膜光损伤；滋阴明目丸

随着社会经济的发展，人们在生活的方方面面与光源密不可分，与损伤性光源的接触也越来越频繁，环境和人造光源都可能是潜在危险因素〔1〕。近年来，对视网膜光损伤的损伤防御机制及防治的研究成为普遍关注的问题，流行病学研究发现视网膜光损伤与视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等疾病有关〔2〕。国内外大量临床基础研究表明，细胞凋亡是视网膜细胞光损伤的主要表现形式之一〔3〕。本实验拟通过建立大鼠视网膜光损伤模型，观察滋阴明目丸对视网膜光损伤后凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物选取6～8周龄健康Sprague-Dawley（SD）大鼠（雌雄不论，湖南斯莱克实验动物有限公司提供，SPF级）60只，每只体质量150～180 g左右。采用随机数字表法分为6组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、滋阴明目丸低剂量组（低剂量组）、滋阴明目丸中剂量组（中剂量组）、滋阴明目丸高剂量组（高剂量组）。所有实验大鼠均在12 h明（20～50 lx）以及12 h暗（0～12 lx）的循环光环境下适应10 d。

1.1.2实验用药滋阴明目丸（湘药制字Z20080745，规格120 g/瓶），湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。主要药物组成：熟地黄、黄精、枸杞子、菟丝子、山茱萸、山药、茯苓、楮实子、牡丹皮、三七、丹参、牛膝、当归、石决明、川芎、羌活、石菖蒲等。杞菊地黄丸（批号201310038，长沙九芝堂集团有限公司），湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，主要药物组成：枸杞子、菊花、熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻等。复方托吡卡胺滴眼液（美多丽，规格10 ml，批号M484351，日本参天制药），湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。滋阴明目丸和杞菊地黄丸均按比例制备成混悬液。

1.1.3主要仪器及试剂TSAI-8720型数字照度计（苏州特安斯电子有限公司）；罗氏公司凋亡试剂盒（货号：11684817910）。

1.2实验方法

1.2.1视网膜光损伤模型制作自制光照箱作为光损伤装置，箱体规格1 m×35 cm×35 cm，箱内垂直4个面和箱底分别安装4根15 W的白色荧光灯管，灯管内侧放置玻璃隔板，上方安装多个排风孔。光照箱中心向各方向的平均照度为（1 900±106.9）lx，相当于大鼠眼球水平正常活动时各箱壁的照度为2000lx，光照箱内的平均温度维持在22～24℃。除空白对照组外，其余组SD大鼠造模前暗适应24 h后均置于乙醚麻醉缸中吸入麻醉约5 min，缝线开睑，并予复方托吡卡胺滴眼液行双眼散瞳处理后，接受3 h持续光照射。光照后立即拆除开睑缝线，送回暗环境中，之后均在12 h明及12 h暗的循环光环境下生活。

1.2.2分组给药造模动物在前述光损伤处理后3d开始给药。根据体表面积计算法，计算出相当于成人的等效治疗量。低剂量组予以滋阴明目丸相当于成人的1/3倍剂量2.6g/kg的混悬液（0.052 g/ml）、中剂量组予成人等效剂量7.8 g/kg的混悬液（0.156 g/ml）、高剂量组予以成人3倍剂量23.4g/kg的混悬液（0.46g/ml）灌胃，阳性对照组予杞菊地黄丸成人等效剂量1.62g/kg的混悬液（0.081 g/ml）灌胃，空白对照组及模型对照组同期予以生理盐水（与成人剂量等容）灌胃。每天上下午分别灌胃1次，每次剂量是全日量的1/2。灌胃后15 d处死大鼠，取眼球送检。

1.2.3制作石蜡切片（1）4%多聚甲醛固定24 h，去掉眼前节及玻璃体，固定大鼠视网膜。（2）组织按常规进行固定、脱水、浸蜡、石蜡包埋。每只眼球经视盘颞上方旁开1 mm纵向切片，切片厚度4 μm。

1.2.4TUNEL法染色（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）加蛋白酶K工作液做酶修复，室温孵育15 min，磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4）洗3次，每次5 min。（3）加破膜工作液常温下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。按片子数量和组织大小取适量试剂1（TdT）：试剂2（dUTP）=1∶9混合，加到组织上，37℃水浴锅孵育60 min，湿盒内加少量水保持湿度。（4）PBS冲洗3次，每次5 min，组织上加入3%新鲜配制的甲醇双氧水，常温避光孵育15 min。（5）PBS冲洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每张切片加适量试剂3（converter-POD），37℃水浴锅孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。（6）甩去PBS液，每张切片加50～100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制显色。（7）显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化（1 s），自来水洗，氨水返蓝，自来水洗，镜下观察。（8）切片经过两道100%乙醇，每道5～10 min，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.5光学显微镜观察视细胞凋亡指数（AI）光学显微镜下观察经TUNEL法标记的凋亡视细胞的切片，切片上的组织为一细长条带，选取这条带的横截中线，在高倍镜（×400）下随机观察中线附近10个视野，计算出这10个视野的总面积和这10个视野内凋亡视细胞的总数，将这一总数作为每张切片的视细胞凋亡数，取5张连续切片视细胞凋亡数的均数作为该眼的视细胞凋亡数，取每只大鼠两眼球视细胞凋亡数的均数作为该大鼠的视细胞凋亡数，用该大鼠的视细胞凋亡数除以10个高倍镜视野的总面积即为该大鼠的视细胞凋亡指数（AI）。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件分析所有数据，计量资料都采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1石蜡切片TUNEL法标记光学显微镜观察

空白对照组，外核层无细胞核被标记（图1A）。模型对照组，SD大鼠视网膜外核层中有阳性细胞核被标记。被标记的阳性细胞核呈棕黄色，核着色不均匀，细胞膜完整，染色质边聚成“新月形核”或“环形核”，核染色质浓缩在中央形成“眼球形核”（图1B）。低剂量组，SD大鼠视网膜外核层中被标记的细胞核减少（图1C）。中、高剂量组及阳性对照组，外核层中被标记的细胞核明显减少，但三组间并无明显组织病理学差异（图1D～图1F）。

2.2视细胞凋亡指数（AI）

模型对照组的AI值远高于空白对照组（63.3077%＞1.5439%，P＜0.01），低剂量组AI值略低于模型对照组，但二者差异无统计学意义（P=0.095）；中、高剂量组及阳性对照组AI值明显低于模型对照组（P值均＜0.01），该三组间两两比较，差异均无统计学意义（中剂量组与高剂量组比较，P=0.639；中剂量组与阳性对照组比较，P=0.886；高剂量组与阳性对照组比较，P=0.733）（表1）。

表1 各组大鼠视网膜视细胞凋亡指数比较（x±s）

图1 各组大鼠视网膜石蜡切片光学显微镜像（TUNEL法标记，×400）。1A.空白对照组，外核层未见细胞核标记；1B.模型对照组，外核层可见阳性细胞核（棕黄色）；1C.滋阴明目丸低剂量组，外核层阳性细胞较模型对照组减少；1D.滋阴明目丸中剂量组，外核层阳性细胞较模型对照组明显减少；1E.滋阴明目丸高剂量组，外核层阳性细胞较模型对照组明显减少；1F.阳性对照组，外核层阳性细胞较模型对照组明显减少

3 讨论

视网膜是人体产生视觉的重要器官，也极易受到内外致病因素的影响。过强的光照或长时间直视光源会对视网膜造成损害。光化学损伤是导致视网膜光损伤最主要的损伤因素，光感受器细胞的死亡途径有三种，分别是凋亡、坏死和自噬，其中，凋亡是主要途径〔4〕。细胞凋亡，又被称为程序性细胞死亡，是指在体内外因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡，是生物体内普遍存在的一种不同于坏死的生理调节性的细胞死亡，具有特殊的形态学改变。凋亡蛋白酶（Caspase）是白介素-1转化酶样蛋白酶，为线虫死亡基因CED-3在哺乳动物中的对应产物。大量研究表明，Caspase可成为细胞进入程序性死亡的特异性标志，凋亡的主要通路分别是Caspase依赖型细胞凋亡通路和Caspase非依赖型细胞凋亡通路。Caspase依据结构和功能的不同，可分为三类：Caspase2，8，9，10为起始凋亡蛋白酶〔5〕；Caspase3，6，7为效应凋亡蛋白酶〔6，7〕；Caspase1，4，5为与炎症相关的凋亡蛋白酶〔8〕。Caspase依赖型凋亡通路主要是起始凋亡蛋白酶和效应凋亡蛋白酶参与，Caspase非依赖型凋亡通路主要以钙蛋白酶或组织蛋白酶介导为主。

中国古代对光损害性眼病即有描述，唐代孙思邈的《备急千金要方》云：“数看日月、夜视星火……并是丧明之本”；《外台秘要》中也提到“数向日月轮看”“雪山巨晴视日”都是“丧明之由”。又根据其“目内外无症候，但自视昏渺矇眛不清”（《审视瑶函》）的临床表现，将其归于“视瞻昏渺”范畴。《证治准绳·杂病·七窍门》指出此症：“有劳神，有血少，有元气弱，有元精亏而昏渺者。”肝开窍于目，肝受血而能视，肾精充足，上荣于目，则视物清晰。持续的光损害，易伤阴耗血，目窍失养，久之肝肾同亏，精血不足，血运不畅，瘀血阻滞。因此我们认为此类眼病的病机与肝肾阴虚，目络瘀滞有关，中医治法可予以滋阴活血之剂。

杞菊地黄丸出自《医级·卷八》，由六味地黄丸加枸杞子、菊花而成，功效为补益肝肾，主治肝肾亏虚，常用于干眼、屈光不正及年龄相关性白内障、年龄相关性黄斑变性等眼底疾病，是眼科的常用方。滋阴明目丸是李传课教授根据数十年的临床经验总结而成，临床应用多年。在提高视力、扩大视野、消散瘀血、改善功能、减轻症状等方面获得了较好疗效。此方主要由熟地黄、黄精、枸杞子、菟丝子、山茱萸、山药、茯苓、楮实子、牡丹皮、三七、丹参、牛膝、当归、石决明、川芎、羌活、石菖蒲等药物组成，方中熟地黄滋补肝肾、填精益髓为君；枸杞子、菟丝子、山药、茯苓、楮实子、黄精、山茱萸为臣，协助君药补肾养阴、益肝明目；牡丹皮、三七、丹参、牛膝、当归止血养血、活血化瘀；石决明平肝除障为佐；羌活辛散防滞，引药上行；石菖蒲开窍宣通为使。诸药合用，共奏滋补肝肾，活血化瘀名目之功。本实验通过建立视网膜光损伤模型，使用光学显微镜观察视细胞凋亡指数，研究显示一定剂量的滋阴明目丸可以抑制光损伤模型大鼠的视细胞凋亡，对光损伤后大鼠的视细胞具有一定的保护作用。但由于视网膜光损伤机制较复杂，光感受器细胞凋亡不是单一因素或某一环节导致，仍需进一步研究。此外，滋阴明目丸是中药制剂，其成分的多样性，作用的多向性导致药理作用的研究欠完善，因此仅以此探讨该药的作用机制稍显不足，有待在今后的研究中进一步完善。

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Effect of Ziyin Mingmu pill on apoptosis of retinal damage in rats

HU Minna,LUO Ping,YAN Jiazhao,et al.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,China

OBJECTIVETo observe effect of Ziyin Mingmu pill on optic cell apoptosis after retinal light injury in Sprague-Dawley(SD)rat.METHODSA total of 60 SD rats were randomly divided into control group, model control group,positive control group as well as low dose,medium dose and high dose of Ziyin Mingmu pill groups,which meant 10 rats in each group.Except control group,rats it the other 5 groups were made into model of retinal light injury,3 days after light injury medication began by gastric.Low,medium and high dose of Ziyin Mingmu pills were equivalent to 1/3 of adult dose(2.6 g/kg,0.052g/ml),the human equivalent dose(7.8 g/kg,0.156 g/ml),tripple adult dosage(23.4 g/kg,0.46g/ml)respectively,positive control group was treated with Qiju Dihuang pill with adult equivalent dose(1.62g/kg.0.081g/ml),blank control group and model control group were given saline. Fifteen days after medication,rats of each group were sacrificed,while the paraffin sections of the retina were made, and TUNEL staining was used to observe the apoptotic index(AI).RESULTSCompared with blank control group, AI of model control group was significant high(63.3077%±4.7531%VS 63.3077%±4.7531%,P<0.001);AI of low dose group was 60.8298±5.9315%which was similar to that of model control group;AI of middle,high dose group and positive control group were all obviously lower than model control group(P<0.001);among these groups, comparisons between each two groups showed no difference at all.Specifically,P value of comparison between medium dose group and high dose group,medium dose group and positive control group,high dose group and positive control group were 0.639,0.886 and 0.733 respectively.CONCLUSIONSA certain dose of Ziyin Mingmu pillcould inhibit cell apoptosis in rat model of light damage,and it had a protective effect on retinal cells after light damage in rats.

apoptosis;retinal light damage;Ziyin Mingmu pill

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0211-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.001

国家自然科学基金项目（81303007/H2713）；全国名老中医药专家李传课传承工作室[国中医药人教发2013（47）号]

1.湖南中医药大学，长沙410208；

2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙410007

罗萍，E-mail：1216718845@qq.com