HPLC-ELSD法检测蜂蜜饮料中4种可溶性糖含量

陈金斌

（温岭市食品药品检验检测中心，浙江温岭317500）

HPLC-ELSD法检测蜂蜜饮料中4种可溶性糖含量

陈金斌

（温岭市食品药品检验检测中心，浙江温岭317500）

建立一种用高效液相色谱-蒸发光检测法测定蜂蜜饮料中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的检测方法。样品经乙腈-水提取，过滤膜后上机检测。采用ZORBAX糖分析色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）分离，以乙腈︰水（30︰70，体积比）作为流动相，用蒸发光检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，4种糖组分在0.05 g/100mL～1.00 g/100mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.993～0.997，检出限在0.005 g/100mL～0.010 g/100mL，定量限为0.015 g/100mL～0.030 g/ 100mL，加标回收率达到89.4%～97.5%。该方法具有前处理简单、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于蜂蜜饮料中葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖的定量检测。

高效液相色谱；ELSD；蜂蜜饮料；糖

蜂蜜是药食同源的天然保健食品，具有很高的营养价值，一直深受消费者的青睐。蜂蜜中固体物质有95.0%～99.9%是糖类，占总成分的70%～80%，这些糖分以单糖为主（即葡萄糖和果糖），通常占蜂蜜总成分的60%以上[1]；其次是双糖，双糖中以蔗糖占绝对优势，其含量从0到5%；其余是麦芽糖、海藻糖、松二糖和昆布二糖等[2]。蜂蜜饮料，是指以蜂蜜为主要原料的系列饮料，不仅具有很好的营养价值，同时也为蜂蜜的深加工提供了一条新途径。常见的蜂蜜饮料有蜂蜜柚子茶、刺梨果蜂蜜汁、蜂蜜速溶茶、蜂蜜胡萝卜汁等，深受消费者喜爱。

然而，消费者在饮用这一系列的饮料时，往往忽视其高糖分饮料容易带来身体危害的事实。本试验就针对此，测定其中主要的4种糖分即葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的含量。目前，食品中糖含量的测定有滴定分析法[3]、气相色谱法[4]、液相色谱法[5-7]和离子色谱法[8-9]等，但结合糖类物质自身易溶于水、低挥发性、不易电离等特点，液相色谱法是目前较理想、实用的检测方法。国家标准GB/T 18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测》[10]中采用液相色谱配示差折光检测器进行测定。但示差折光检测器依据折射率的变化对样品进行检测，极易受温度、流动相梯度等条件的影响，导致谱图基线漂移，灵敏度偏低，实际应用并不理想。蒸发光散射检测器（ELSD）基于样品颗粒对光的散射与质量呈指数关系进行测定，与被测物质的官能团和光学性质无关[11-12]，且受温度、梯度洗脱等试验条件影响小，适合于无紫外吸收或只有紫外末端吸收、低挥发性物质的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱系统（配2424型ELSD检测器）：Waters。

葡萄糖标准品、果糖标准品、蔗糖标准品、麦芽糖标准品：购于国家标准物质中心；甲醇、乙腈为色谱纯。

1.2 样品来源

样品均为随机购买市场上销售的蜂蜜饮料。

1.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX糖分析色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.2mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。

1.4 方法

1.4.1 流动相体系对糖分色谱行为的影响

固定流动相流速1.2mL/min，配制不同比例的流动相Ⅰ（乙腈∶水=40∶60，体积比）、流动相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，体积比）、流动相Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，体积比）、流动相Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，体积比），考察不同流动相体系对4种糖分色谱行为的影响。

1.4.2 ELSD条件的优化

ELSD的两个较重要的参数分别是漂移管温度和载气流速（或者载气压力），两者对组分的保留时间影响较小，但对信噪比（S/N）的影响较大，一般建立适当的HPLC-ELSD分析方法时，需对这两个参数进行优化。

1.4.3 标准曲线的制作

称取相应质量的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖标准品，配制成浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 g/ 100mL的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.4 样品前处理条件的优化

蜂蜜饮料中除了固有的一些食品基质外，还含有很多的人为添加的营养元素，成分复杂，对前处理要求高，所以本试验样品前处理对3种不同的提取液Ⅰ：甲醇-水（体积比1∶1）、提取液Ⅱ：乙醇-水（体积比1∶1）、提取液Ⅲ：乙腈-水（体积比1∶1）进行比较，以样品加标平均回收率为比较依据，制定较优的前处理条件。

1.4.5 加标回收试验

以市售蜂蜜饮料为基质，加入4种糖分的混标溶液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 流动相体系对糖分色谱行为的影响

由于ELSD在雾化过程中需将流动相及样品溶剂挥发，形成被测样品微颗粒进行散射光检测，因此，试验中不使用不易挥发的缓冲盐（如乙酸铵等）进行色谱行为的调节。试验考察不同比例的流动相Ⅰ（乙腈∶水=40∶60，体积比）、流动相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，体积比）、流动相Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，体积比）、流动相Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，体积比）对4种糖分分离效果的影响。结果表明：流动相中水的比例对容量因子影响显著，随水含量的增加，各组分保留时间明显提前，容量因子逐步减小。当水含量高于40%（体积分数）时，果糖、葡萄糖峰形重叠。其中流动相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，体积比）的分离度最好，果糖、葡萄糖能分开，并且可得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适，如图1所示。

图1 葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖的色谱图Fig.1 The chrom atogram of glucose，fructose，sucrose，maltose

2.2 ELSD条件的优化

试验考察了不同载气流速（载气压力）1.5（20 psi）、2.0（30 psi）、2.5（40 psi）、3.0 L/min（50 psi）和不同漂移管温度40、50、60、70、80℃对检测响应值的影响。结果表明：载气流速对响应值的影响比漂移管温度对响应值的影响明显。结合试验中液相色谱的流量，合理的载气流速可以保证被测样品微雾滴的有效形成。漂移管温度的调节更多地体现在对基线噪声的影响上。当被测样品以微雾滴形式进入漂移管时，比表面积的大幅增加使溶剂的挥发温度远低于通常的沸点，随着温度的升高，目标物峰面积的变化趋缓，噪声增加，信噪比反而下降。

保持漂移管温度60℃，以0.05 g/100mL 4种糖分混合标准溶液的信噪比（S/N）考察最佳载气流速。结果表明：载气流速过小，雾化不充分，过大则可能导致目标物的损失，信号值降低。载气流速由1.5 L/min升至3.0 L/min时，各组分的信噪比随载气流速呈抛物线变化；当载气流速为2.0 L/min时，信噪比达到最高，试验选择载气流速为2.0L/min。保持载气流速为2.0L/min，调节不同漂移管温度，试验考察了0.05 g/100mL 4种糖分混合标准溶液的峰面积变化情况。结果表明：漂移管温度在40℃～90℃之间时，峰面积呈下降趋势，但幅度不明显，尤其高于60℃后变化更趋平缓，考虑到温度太低溶剂挥发不完全，基线不稳，试验选择漂移管温度为60℃。

在载气流速为2.0 L/min、漂移管温度60℃条件下，一款蜂蜜饮料中检测出葡萄糖、果糖和蔗糖的色谱图如图2所示。

图2 蜂蜜饮料中葡萄糖、果糖和蔗糖的色谱图Fig.2 The chrom atogram sof glucose，fructose，sucrose in honey drink

2.3 标准曲线的制作

为了验证4种糖分在乙腈∶水=30∶70（体积比）流动相体系中的线性关系，配制了葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 g/100mL的系列混合标准溶液。试验结果表明，4种糖分在0.05 g/100mL～1.00 g/100mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的性噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到4种目标组分的LOD和LOQ分别为0.005 g/100mL～0.010 g/100mL和0.015 g/100mL～0.030 g/100mL，结果见表1。

表1 4种糖分的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection lim itand quantitative lim itof four kindssugar

2.4 提取液的选择

参考相关文献 [10，13]，针对于样品提取液的选择，分别选用提取液Ⅰ、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ来进行比较，分别称取2.0 g试样于50mL具塞塑料离心管中，加入提取液定容至刻度，旋涡振荡2min，用0.45μm滤膜将样液过滤入样品瓶中供液相色谱测定。

试验结果以4种糖分的平均回收率为比较依据，如图3所示，乙腈-水（体积比1∶1）作为提取液效果最好，4种糖分的回收率较好。

图3 提取液选择对4种糖分平均回收率的影响Fig.3 Theeffectof extract solution on theaverage recovery rate for the four kindsof sugar

2.5 样品的测定及加标回收

在我们随机抽取的20个批次的蜂蜜饮料样品中，根据上述试验结果选择优化后仪器条件，选择乙腈-水（体积比1∶1）溶液提取，过滤后上机检测。结果表明：在所检测的运动饮料样品中，果糖值在13.5mg/g～24.6 mg/g之间，葡萄糖值在12.3 mg/g～20.5 mg/g之间，蔗糖值在9.4mg/g～56.5 mg/g之间，麦芽糖值在0.2mg/g～2.4mg/g之间。加标回收试验中，在加标浓度为0.50 g/100mL的饮料样品中，4种糖分的加标回收率在89.4%～97.5%之间，符合检测要求。

3 结论

本文建立了一种高效液相色谱-蒸发光检测器检测蜂蜜饮料中葡萄糖、果糖、蔗糖以及麦芽糖的分析方法。结果表明，在乙腈∶水=30∶70（体积比）流动相体系中，在载气流速为2.0 L/min、漂移管温度60℃的条件下葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖4种组分能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。样品在经提取液：乙腈-水（体积比1∶1）的提取下，可实现对目标物的净化，准确有效地检测蜂蜜饮料中的葡萄糖、果糖、蔗糖以及麦芽糖。

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Determ ination of 4 Kinds Soluble Sugar in Honey Drink by HPLC-ELSD

CHEN Jin-bin
（Wenling Food and Drug Inspection Center，Wenling317500，Zhejiang，China）

A rapid and effectivemethod was established for the determination of glucose，fructose，sucrose，maltose in honey drink by high performance liquid chromatography-ELSD detectionmethod.The sampleswere extracted by acetonitrile-water，and detected on themachineafter filteringmembrane.The separation of targeted compoundwasperformed on a ZORBAX sugaranalysischromatography column（4.6mm×250mm，5μm）using acetonitrile：water（30∶70，volume ratio）asmobile phase，with ELSD detectorand external standardmethod peak area quantification.The linear range of four kindssugarwas in the rangeof0.05 g/100mL-1.00 g/100mL with a correlation coefficientof 0.993-0.997.The detection limitwas 0.005 g/100mL-0.010 g/100mL and the quantitative limitwas0.015 g/100mL-0.030 g/100mL.The recovery ratewas89.4%-97.5%.Themethod has theadvantagesofsimplepretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fastdetection rate，and issuitable for the quantitative detection ofglucose，fructose，sucroseandmaltose in honey drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；ELSD；honey drink；sugar

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.033

2016-08-01

陈金斌（1983—），男（汉），工程师，本科，研究方向：食品中农药兽药残留、食品中添加剂、食品中微量元素等检测。