TTC在乳及乳制品菌落总数检测中的应用

刘胜桃，秦思文，鲍晓凤，关蕴杰，高然，李艳玲，朱璐

（蒙牛乳业（沈阳）有限责任公司，辽宁沈阳110122）

TTC在乳及乳制品菌落总数检测中的应用

刘胜桃，秦思文，鲍晓凤，关蕴杰，高然，李艳玲，朱璐

（蒙牛乳业（沈阳）有限责任公司，辽宁沈阳110122）

检测乳及乳制品菌落总数，为达到菌落在培养基中清晰可辨，在平板计数琼脂培养基中添加2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）。以灭菌乳、发酵乳、冰淇淋为样品基质，分别加入适当菌含量的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌工作菌悬液，制备适当浓度的TTC平板计数琼脂，同时以不添加TTC的平板计数琼脂作为对照，对同一样品进行菌落计数并同国标方法结果进行对比。TTC平板计数琼脂终浓度在0.001%～0.002%时能够使菌落显色，且与不添加TTC的对照组对比结果一致。在检测成分复杂的乳及乳制品样品时添加适宜浓度的TTC，有助于菌落的辨认，能够提高检验人员菌落计数的准确性，可用于检测乳及乳制品中菌落总数。

2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）；乳及乳制品；菌落总数；检测；平板计数琼脂

菌落总数是评价食品卫生情况、新鲜程度及污染程度最常用的指标之一[1]。作为一方实验室，准确的检测结果是实验室检测水平的重要体现，提供的数据能为生产过程提供指导方向，提升实验室在客户中的信誉度和权威性。目前国内采用的菌落计数方法有国标平板计数法、纸片法[2-3]。随着中国乳业的迅速发展，消费观念逐渐成熟以及强烈的市场需求，乳制品产品种类日益丰富，如酸牛乳、调制乳、乳粉、冰淇淋等，为了丰富口感有些产品中添加了果粒、果酱、谷物等成分，使得产品基质变得复杂，检测时由于样品中部分成分不能溶解，计数时易与菌落发生混淆，为菌落总数检测工作增加了难度。

2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）是四唑盐，细菌能将含有偶氮基的四唑盐还原成甲臜，即细菌能把TTC还原成红色甲臜形成红色菌落[4-6]，菌落与颗粒就能明显被区分开。但TTC浓度过高会抑制细菌的生长，因此确定TTC的使用浓度是保证检验结果准确性的重要前提，《化妆品卫生规范》（2007版）中明确注明为便于区分化妆品中颗粒与菌落，可在营养琼脂中加入TTC溶液[7]。也有学者认为TTC添加浓度0.2%为宜[8]。因TTC的添加浓度说法不一，影响因素较多，本试验以灭菌乳、巴氏杀菌热处理风味酸牛奶、冰淇淋为试验样品，并添加大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌，在平板计数琼脂中加入不同浓度的TTC溶液分别进行试验，同时与国标法进行对比，研究不同浓度TTC平板计数琼脂对乳及乳制品菌落计数的影响，确定最适宜的TTC添加浓度，用于检测乳及乳制品中菌落总数。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与样品来源

大肠埃希氏菌（Escherichia coli ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus ATCC 6538）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis ATCC 6633），均来自于美国标准菌种保藏中心。

试验样品（灭菌乳、巴氏杀菌热处理风味酸牛奶、冰淇淋）均由蒙牛乳业提供。

1.1.2 主要仪器与试剂

生物安全柜HR40-ⅡA2：青岛海尔特种电器有限公司；恒温培养箱SKP-02B：黄石市恒丰医疗器械有限公司；漩涡混合器MS3 basic：上海精密仪器仪表有限公司。

平板计数琼脂（CM101）、4%TTC溶液1mL/支（P-79A），以上培养基及试剂均来自于北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工作菌株制备

将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌标准储存菌株，分别加入10mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于（36±1）℃培养18 h～24 h后划线胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板，对菌种纯度、形态特征及生化特征进行确认。将经确认的典型菌落作为工作菌株使用。

1.2.2 TTC平板计数琼脂制备

使用商品化平板计数琼脂（CM101），按培养基标签要求进行基础培养基的制备。待培养基冷却至47℃～50℃时，以无菌操作加入4%TTC溶液，使培养基终浓度分别为：0.000 2%、0.000 4%、0.000 6%、0.000 8%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%，混匀后置于（46±1）℃水浴锅中备用。

1.2.3 含菌样品的制备

人格的定义为个体思考、感知和行为的特有模式。心理学家通过查阅字典，将几千个对人性格评价的词汇归纳总结出五种主要的性格特质。这五种特质几乎可以全面涵盖人格的不同维度。通过多年的样本实验，大五人格已经成为心理学公认的理解人格最好的模型之一。该理论将所有的人格特质分为主要的五个维度:尽责性、外向性、宜人性、情绪稳定性以及外向性。

将4种工作菌液进行系列稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度菌液各1mL，分别加入试验样品中（灭菌乳、巴氏杀菌热处理风味酸牛奶、冰淇淋），使最终样品菌含量在20CFU/mL～200CFU/mL之间。

1.2.4 操作步骤

取样品25 g加入225mL生理盐水中，可均质处理，制成体积比为1∶10的样品匀液。吸取体积比为1∶10稀释样品匀液1mL注入9mL稀释液中，混合制体积比为1∶100稀释的样品匀液。依次制备10倍系列稀释样品匀液。选择3个适宜稀释度，各吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，做平行检测，同时作空白对照。将15 mL～20mL冷却至46℃的TTC平板计数琼脂培养基和不含TTC的平板计数琼脂倾注平皿，混合均匀。待琼脂凝固后，于（36±1）℃培养（48±2）h。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况

大肠埃希氏菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况如表1所示。

表1 大肠埃希氏菌在不同TTC浓度平板计数琼脂生长试验结果Table1 Thegrow th of Escherichia coliin different concentration of TTC platecountagar

大肠埃希氏菌在终浓度为0.000 4%～0.000 8%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，菌落颜色较浅呈淡粉色，指示作用不明显，菌落数量较对照组无明显差异；大肠埃希氏菌在终浓度为0.001%～0.010%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，颜色呈粉红色到紫红色，有助于菌落辨认，且菌落数量较对照组无明显差异（lg差小于r，r=0.25）；当TTC浓度≥0.02%时菌落生长情况受到了不同程度的抑制，且菌落数量较对照组明显减少。

2.2 金黄色葡萄球菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况

金黄色葡萄球菌对TTC较敏感，在终浓度为0.000 4%～0.000 8%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，菌落颜色较浅呈淡粉色，指示作用不明显，菌落数量较对照组无明显差异；黄色葡萄球菌在终浓度为0.001%～0.002%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，颜色呈粉色到红色，菌落清晰可辨，且菌落数量较对照组无明显差异（lg差小于r，r=0.25）；当TTC浓度在0.004%～0.08%时菌落生长情况受到了明显的抑制，且菌落数量较对照组明显减少，当TTC浓度≥0.01%时金黄色葡萄球菌即被完全抑制不能生长。

表2 金黄色葡萄球菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长试验结果Table2 Thegrow th of Staphylococcusaureus in different concentration of TTC plate countagar

2.3 粪肠球菌在不同TTC浓度平板计数琼脂生长情况

粪肠球菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况如表3所示。

表3 粪肠球菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长试验结果Table3 Thegrow th of Enterococcus faecalis in different concentration of TTC plate countagar

粪肠球菌与大肠埃希氏菌生长情况相似，在终浓度为0.000 4%～0.000 8%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，菌落颜色较浅呈淡粉色，指示作用不明显，菌落数量较对照组无明显差异；粪肠球菌在终浓度为0.001%～0.01%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，颜色呈粉红色到紫红色，菌落清晰可辨，且菌落数量较对照组无明显差异（lg差小于r，r=0.25）；当TTC浓度≥0.02%时菌落生长情况受到了不同程度的抑制，且菌落数量较对照组明显减少。

2.4 枯草芽孢杆菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况

枯草芽孢杆菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况如表4所示。

枯草芽孢杆菌在终浓度为0.000 4%～0.000 8%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，菌落颜色较浅呈淡粉色，指示作用不明显，菌落数量较对照组无明显差异；枯草芽孢杆菌在终浓度为0.001%～0.01%的TTC平板计数琼脂上菌落生长良好，颜色呈粉色到紫红色，且菌落中心颜色较深更有助于单个菌落的辨认，减少由于菌落重叠而引起的计数误差，且菌落数量较对照组无明显差异（Lg差小于r，r=0.25）；当TTC浓度≥0.02%时菌落生长情况受到了不同程度的抑制，且菌落数量较对照组明显减少。

表4 枯草芽孢杆菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长试验结果Table4 Thegrow th of Bacillussubtilis in different concentration of TTC plate countagar

2.5 小结

通过2.1-2.4试验，使用TTC平板计数法对乳及乳制品中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌分别进行试验，结果显示TTC平板计数琼脂终浓度适宜范围为0.001%～0.002%（含0.001%和0.002%），在该浓度下能很好的使菌落显色，同时又不会抑制细菌生长。

2.6 准确度

使用国标方法及TTC法（TTC平板计数琼脂终浓度0.002%）分别对25组人工污染的乳及乳制品进行菌落总数测定，利用T检验法分析检测结果的准确度，T临界值=2.06（a=0.05），T计算值=0.054，T计算值＜T临界值，两组数据无显著差异，如表5所示。

表5 TTC法与国标方法测定乳及乳制品菌落总数结果Table5 The determ ination resultsof conloniesnumber of TTC and nationalstandardmethod inm ilk and dairy products CFU/mL（g）

3 结论与讨论

在食品的加工、贮藏、运输过程中被污染的细菌种类很多，包括致病菌，条件致病菌和非致病性细菌[9]试验选取革兰氏阴性菌代表种-大肠埃希氏菌及革兰氏阳性菌代表种-金黄色葡萄球菌（代表葡萄球菌属）、粪肠球菌（代表链球菌属）、枯草芽孢杆菌（代表芽孢杆菌属）。试验结果表明TTC指示剂对革兰氏阳性菌的抑制性较革兰氏阴性菌略强。其中金黄色葡萄球菌对TTC最为敏感，当TTC平板计数琼脂终浓度在0.000 2%～0.002%时生长良好，当TTC平板计数琼脂终浓度≥0.004%时即会对金黄色葡萄球菌产生不同程度的抑制[7]。大肠埃希氏菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌在TTC平板计数琼脂终浓度0.000 2%～0.01%时生长良好，当TTC平板计数琼脂终浓度≥0.02%时产生不同程度的抑制[10]。本次试验证明在培养基中加入适当浓度的TTC能够易于鉴别菌落，并且不影响细菌本身的生长繁殖[11]。

TTC平板计数法检测乳及乳制品中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌，TTC指示剂终浓度适宜范围为0.001%～0.002%（含0.001%和0.002%），在该浓度下能很好的使菌落显色，同时又不会抑制细菌生长。

本方法与测试片一类的商品化快速培养基相比，其检测流程更接近于传统的国标方法，能够为菌落提供足够的生长空间，更有利于对菌落形态的观察。成本低廉，操作简便，且灵敏度高，菌落在TTC平板计数琼脂上呈粉红色至红色，部分芽孢菌落还会产生红色中心，在检测成分复杂的乳及乳制品样品时有助于菌落的辨认，能够提高检验人员菌落计数的准确性，可用于检测乳及乳制品中菌落总数。

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The Application of TTC in the Detection of Conlonies Number of M ilk and Dairy Products

LIUSheng-tao，QINSi-wen，BAOXiao-feng，GUANYun-jie，GAORan，LIYan-ling，ZHU Lu
（Mengniu Dairy Industrial（Shenyang）Co.Ltd.，Shenyang110122，Liaoning，China）

In order to achieve the clear colony in themedium，we detect the totalnumberof coloniesofmilk and dairy products by adding 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloridechloride（TTC）into plate count agar culture medium supplemented.Compared with the national standard method，we use the same samples.This experimentused sterilizationmilk，fermentedmilk，ice cream as the samplematrix，and added appropriate contentof Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis，bacillus coli bacteriasuspensionrespectively，which is aim to the preparation of appropriate concentration of TTC Plate Count Agar.At the same time，the plate countagarwithout TTCwasused as the controlgroups in this test.The concentration of TTC plate countagarbetween 0.001%and 0.002%，canmake the colony color，and the resultswere consistentwith the control groupwhich did notadd TTC.Theappropriate concentration of TTC indicatorwasapplied to the detection of totalbacterial count inmilk and dairy products，which isnotonly helpful to identify the colony，butalso can improve theaccuracy of the countof the colony count.

2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride；milk and milk products；the total number of colonies；detection；plate countagar

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.032

2016-08-29

刘胜桃（1986—），女（汉），本科，研究方向：乳及乳制品微生物学。