生物膜中活性菌株的鉴定及抑菌活性研究

李志生，丛巍巍，张华庆，王 科，于雪艳，桂泰江

（1.海军91421部队，山东青岛 266071；

2.海洋涂料国家重点实验室，海洋化工研究院有限公司，山东青岛 266071）

生物膜中活性菌株的鉴定及抑菌活性研究

李志生1，丛巍巍2，张华庆2，王 科2，于雪艳2，桂泰江2

（1.海军91421部队，山东青岛 266071；

2.海洋涂料国家重点实验室，海洋化工研究院有限公司，山东青岛 266071）

对采集于青岛港六号码头浮筏的防污涂料样板上的生物膜进行分离和纯化，共获得细菌26株，酵母菌23株，并对其进行活性菌株的筛选，最终获得具有抑菌活性的细菌7株，酵母菌1株，通过基因测序确定不同菌株的种属，为环境友好型防污剂的获得提供基础。

生物膜；活性菌株；抑菌活性；防污剂

0 引言

任何浸入海水中的设施都难以摆脱海洋生物的污损，有机物（如多糖、蛋白、糖蛋白等）或颗粒（如无机物）数秒内在基体表面聚集，形成富含蛋白的基膜（conditioning film）［1］。随后细菌与单细胞硅藻等微生物迅速在基膜上沉积，分泌胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）［2］，依靠EPS的包覆保护，细菌以及硅藻最终粘附在基膜上，形成生物膜，其形成过程如图1所示。

图1 生物膜形成过程Figure 1 The formation process of biofilm

生物膜的形成是海洋污损生物群落形成的初级阶段，它与随之而来的大型污损生物附着有着复杂的关系。生物膜中细菌等微生物之间，以及它们与无脊椎动物幼虫、藻类孢子之间相互作用，相互影响。细菌等微生物通过物理作用调节生物膜，影响无脊椎动物幼虫以及藻类孢子与基材之间的吸引作用，或是产生并释放一些化学物质（如硫化氢、有机酸、有机酮、有机醛等），抑制接触到生物膜的污损生物的粘附［2］。

行之有效的商品化防污涂料大多依靠向周围海水中缓慢释放防污剂［3］，尽管具有较好的防污效果，但对非目标生物产生许多负面影响，例如防污剂和它们的代谢物在生物体内累积［4］以及破坏其内分泌系统等［5］。国际海事组织（IMO）和海洋环境保护组织（MEPC）禁止使用某些毒性防污涂料，各国纷纷提高防污涂料的市场准入门槛，因此环境友好型防污剂的开发与使用凸显其重要性。近年来，从天然产物提取次级代谢物等活性物质作为有毒防污剂替代产品的探索一直没有停住脚步。本研究通过对青岛海域生物膜中的微生物进行分离纯化，考察提取菌株的抑菌活性，为环境友好型防污剂的探索研究提供基础指导。

1 生物膜的培养

试验过程中，依照国家标准制得防污涂料样板［6］，并将其置于青岛港六号码头浮筏浸海深1 m。两周之后，样板表面生物膜已基本趋于成熟，如图2所示。

2 菌株提取分离

将采集的生物膜进行初步处理，清洗其中的淤泥，在2216E和YPD培养基（酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基）［7］中培养。首先进行摇菌，在28℃，200 r/min的摇床中振荡培养发酵2 d，其次用乙酸乙酯萃取发酵液，采用旋转蒸发仪对萃取液进行浓缩，将浓缩液用无菌生理盐水分别稀释105、106、107倍，涂布于2216E液体培养基和YPD固体培养基上，置于28℃恒温箱中培养2 d。从涂布培养好的固体培养基上挑取单菌落在新的培养基上划线纯化（三线法），往复几次，以得到纯的菌株。经过筛选，共分离提取酵母菌23株，细菌26株。图3为分离纯化的具有代表性的酵母菌以及细菌的图片。

图3 分离纯化具有代表性的菌株图片Figure 3 The pictures of separated and purified representative bacterial strain

3 已筛选菌株的抑菌试验

在研究过程中，采用鳗弧菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌和恶臭假单胞菌作为受试菌株，选取分离纯化的各菌株接种于2216E液体培养基，摇床28℃摇瓶培养24 h；而产铁载体的酵母菌则接种于产铁载体液体培养基（蔗糖2.5%，NH4NO30.3%，K2HPO40.3%，柠檬酸0.1%，MgSO40.008%，ZnSO40.000 2%，pH=6.8）中，摇床28℃摇瓶培养48 h。用移液枪吸取100 μL上述菌液于1 mL无菌海水中混匀。用棉棒蘸取少量菌液在2216E液体培养基或YPD固体培养基上均匀涂布；将牛津杯轻放于固体培养基上，取100 μL各纯化发酵液、离心液和过滤液注入牛津杯中；28℃培养箱内培养48 h后观察抑菌圈，对抑菌圈直径进行测量，每个抑菌圈测定3次，取平均值。

3.1 海洋细菌抑菌性能研究

以Blank1菌株为例，研究发现Blank1菌株发酵上清液对蜡状芽孢杆菌有很强的抑制作用（见图4），而将其发酵上清液煮沸则发现失去抑制作用。由此可知，Blank1菌株发酵上清液中活性成分不耐高温，在煮沸条件下失活。将菌株发酵上清液溶于二甲基亚砜（DMSO）后发现，较单纯的上清液抑菌活性降低，而DMSO本身对蜡状芽孢杆菌没有抑制作用，这说明DMSO对上清液中的活性成分有一定的杀灭作用。

图4 Blank1菌株发酵上清液对蜡状芽孢杆菌的抑制作用Figure 4 The inhibition to Bacillus cereus of fermentation supernation of Blank1 strain

3.2 海洋酵母菌抑菌性能研究

以菌株6为例，从新鲜培养48 h的YPD上挑取两环菌苔接入装有50 mL产铁载体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃且转速为200 r/min的振荡培养箱中振荡培养24 h，作为种子液，测定种子液外径为600 nm。每次试验以相同的接种量（初始pH为0.36）接种于装有50 mL产铁载体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃以及200 r/min下振荡培养120 h。抑菌试验过程中，上述菌株6培养菌液在4℃和10 000 r/min转速下离心5 min，取上清液，然后进行不同处理：A组培养液加热煮沸10 min；B组培养液不加热；C组培养液加入3 μmol/L的FeCl3溶液，分别用一次性过滤器对这3组样品进行过滤除菌，待用。向产铁载体培养基中加入3 μmol/L FeCl3溶液，培养的菌株6的菌液，在4℃和10 000 r/min转速下离心5 min，取上清液，即得培养基中含Fe3+的D组样品。菌株6经过不同处理方法对海洋鳗弧菌的抑菌圈结果见图5。其中E组为标准样品；F组为空培养基；G组为生理盐水，均用于与培养液抑菌效果作对照。

图5 菌株6对海洋鳗弧菌的抑菌圈Figure 5 The inhibition zone of strain 6 to the Marine Vibrio anguillarum

由图5可见：菌株6经离心取上清液煮沸的A组培养液和未经加热处理的B组培养液抑菌圈直径大小相当，即抑菌效果相当。这表明菌株6的活性成分耐高温效果较好，不会在较高温度下失活。样品中加入Fe3+后（C、D组培养液），菌株6均失去抑菌活性。

通过对海洋生物膜中提取的26种海洋细菌和23种海洋酵母菌进行抑菌试验研究，发现具有抑菌活性的细菌7种，酵母菌1种，所得结果如表1所示。

表1 具有抑菌活性的菌株对4种受试菌株抑菌活性比较Table 1 The comparison of antibacterial activity of strains with antibacterial activity to four test strains

由表1可见：8种菌株对海洋鳗弧菌均具有较好的抑菌效果，而菌株VI上1和VI上3抑菌效果稍差于其他6种菌株；而对蜡样芽孢杆菌的抑菌作用以菌株Blank-1和7219的效果最优，菌株VI上1和VI上3效果其次，而其余4种菌株对蜡样芽孢杆菌不具有抑菌效果；所有菌株对绿脓杆菌和恶臭假单胞菌均没有抑菌效果。

3.3 活性菌株16srRNA或26SrRNA测序以及种属确定

VI下4-16SrRNA测序结果：GTGGTTGAGGGG GGGGGCGGCTATCATGCAGTCGAGCGATGGATTAA GAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGA；

VI上3-16SrRNA测序结果：TATACGCAGCGG CGCTCCTATCTGCAGTCGAGCGCAGGAACTGACGG AACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAATGA；

VI上1-16SrRNA测序结果：ATAAACCATCCTG CGGTCCTATCATGCAGTCGAGCGCAGGAACTGACG GAACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAAT；

Blank-16SrRNA测序结果：TGCAGTCGAGCGG TAACATTTCTAGCT TGCTAGAAGATGACGAGCGGC GGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGC；

7219-16SrRNA测序结果：GTCGCGCTAAATTC AGTGACGGGAACTTGTGCTTGCCTCGTGGATCAGTG GCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACC；

1-16SrRNA测序结果：TGGCTCCATAAAGGTT ACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA；

2-16SrRNA测序结果：GGCTCCATAAAGGTTA CCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTG TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA；

6-16SrRNA测序结果：AGGAAAAGAAACCAAC AGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAC AGCTCAAA。

通过活性菌株基因测序最后确定其种属，如表2所示。其中一种出芽短梗霉为海洋酵母菌，其他均为海洋细菌。

表2 具有抑菌活性的菌株名称以及种属Table 2 The name and species of strains with antibacterial activity

4 结语

青岛六号码头海域生物膜中活性菌株以海洋细菌数量占优，且以杆状菌属居多。本研究通过对生物膜中活性成分提取分离，共获得具有抑菌活性的海洋细菌7株，海洋酵母菌1株，为环境友好型防污剂的研究提供了理论指导。

1 Callow M E，Fletcher R L. The Influence of Low Surface Energy Materials on Bioadhesion-a Review［J］. International Biodeterioration and Biodegradation，1994，34（3-4）：333-348.

2 Wingender J，Neu T R，Flemming H C. Microbial Extracellular Polymeric Substances：Characterization，Structure and Function［M］. Germany：Springer Verlag，2012.

3 黄宗国，蔡如星. 海洋污损生物及其防除［M］. 北京：海洋出版社，1984.

4 Horiguchi T. The Endocrine-Disrupting Effect of Organotin Compounds for Aquatic Organisms［J］. Ecotoxicology of Antifouling Biocides，2009（3）：125-146.

5 Chambers L D，Stokes K R，Walsh F C，et al. Modern Approaches to Marine Antifouling Coatings［J］. Surf. Coat. Technol.，2006（201）：3 642-3 652.

6 Thomas K，Brooks S. The Environmental Fate and Effects of Antifouling Paint Biocides［J］. Biofouling，2010（26）：73-88.

7 GB/T 5370—2007防污漆样板浅海浸泡试验方法［S］.

8 何培青，田黎，李光友，等. 海洋细菌B-9987发酵条件的优化及胞外抑菌物质的理化特性［J］. 中国海洋药物，2001（2）：8-12.

The Identification of Bioactive Strains from Biofilm and Research of Their Antibacterial Activity

Li Zhisheng1，Cong Weiwei2，Zhang Huaqing2，Wang Ke2，Yu Xueyan2，Gui Taijiang2
（1.No.91421 Navy，Qingdao Shandong，266071，China；2.State Key Laboratory of Marine Coatings，Marine Chemical Research Institute Co.，Ltd.，Qingdao Shandong，266071，China）

The biofilm was collected from test panels with antifouling coatings which were hung at No.6 dock in Qingdao Harbour. 26 strains of bacteria and 23 strains of yeasts were obtained from isolation and purification of the collected biofilm. After the sifting through bioactive strains，active substances of 7 strains of bacteria and 1 strain of yeast with antibacterial activity were obtained. The species of active strains were identified by DNA sequencing，providing theoretical basis for the acquisition of environment-friendly antifoulant.

biofilm；bioactive strain；antibacterial activity；antifoulant

O 658.9

A

1009-1696（2016）05-0006-04

2016-03-17

青岛市市南区科技计划项目（项目编号：2015-6-024-ZH）。

李志生，男，大学本科，高级工程师，主要从事舰船防腐蚀及防污涂料的研发工作。

丛巍巍，女，博士，高级工程师，主要从事环境友好型海洋防污涂料的研发工作。