T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料修复兔桡骨骨缺损的实验研究*

邱 皓，董 靖，卢公标，卢旻鹏△，曹春风，王群波，张铭华△

(1.重庆医科大学附属永川医院骨科,重庆 402160；2.山东省济宁市人民医院骨科 272011)



T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料修复兔桡骨骨缺损的实验研究*

邱 皓1，董 靖1，卢公标2，卢旻鹏1△，曹春风1，王群波1，张铭华1△

(1.重庆医科大学附属永川医院骨科,重庆 402160；2.山东省济宁市人民医院骨科 272011)

目的 探讨T-CAM表面修饰纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)复合骨修复材料修复兔桡骨中段骨缺损的疗效。方法 选择36只成年新西兰大白兔，建立右桡骨中段1.5cm骨缺损模型后分为两组：实验组植入T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料；对照组植入n-HA/PA66。观察术前，术后2、4、8、12周静脉血碱性磷酸酶(ALP)值；术后4、8、12周每个时间点处死6只兔子，进行X线片、大体标本观察、组织学等观察桡骨骨缺损愈合情况。结果 所有兔子术后切口均一期愈合，无死亡，无体内植入材料脱落。影像学及组织学结果表明实验组在术后4周就有新生骨组织，随着时间的延长，实验组新骨生长速度和数量明显优于对照组，术后12周Lane-Sandhu法X线片和组织学评分实验组均高于对照组(P<0.05)；术后2周实验组ALP值开始升高，随着时间的推移，两组ALP值均升高，术后8周达最高峰，之后开始下降，在12周时接近于术前，静脉血ALP值在术后第2、4、8周与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料具有促进骨质愈合的作用，尤其在早期修复骨缺损的效果优于n-HA/PA66。

桡骨；碱性磷酸酶；骨折愈合；骨缺损；纳米羟基磷灰石；聚酰胺66

骨缺损的修复是困扰骨科医生的难题之一。纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide 66,n-HA/PA66)复合骨修复材料是本课题组前期开发的具有优良的生物学性能和类骨活性的骨修复材料[1]。T-CAM黏附分子(Tetra-cell adhesion molecule)是包含RGD(arginine-glycine-aspartic acid)，PHSRN(proline-histidine-serine-arginine-asparagine)，EPDIM(glutamic acid-proline-aspartic acid-isoleucine-methionine)，YH(tyrosine-histidine)4个序列互补性修饰的黏附分子，能够促进细胞的黏附与扩散，动物实验表明复合T-CAM黏附分子的脱钙骨有良好的修复骨缺损能力[2]。本研究将T-CAM黏附分子修饰于n-HA/PA66上，制备T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料，观察其对兔桡骨中段骨缺损的修复能力，并为其应用于临床提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 n-HA/PA66复合骨修复材料(材料规格： 4.0 mm×15.0 mm圆柱体)。

1.2 方法

1.2.1 T-CAM表面修饰nHA/PA66复合骨修复材料的制备 按文献[3]制备T-CAM黏附分子。将n-HA/PA66复合骨修复材料置入溶有一定量T-CAM黏附分子的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡24 h后室温下风干，然后在水提取器除去未被修饰的T-CAM，制得T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料。

1.2.2 骨缺损动物模型制备及实验分组 4～6月龄健康成年新西兰大白兔(由重庆医科大学实验动物中心提供，雌雄不限)用速眠新(3 mL/kg)麻醉后，按孟纯阳等[4]的方法制作节段性右侧桡骨中段骨缺损模型，缺损长度1.5 cm。将36只造模成功的新西兰大白兔分为两组，每组18只。其中，实验组植入T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料(图1)；对照组植入n-HA/PA66复合材料。所有兔子术后均分笼饲养，每天每只肌内注射青霉素8×105U(分2次)，稀碘伏消毒伤口(2次/天)，连续3 d。

图1 实验组术中植入材料

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 一般情况观察 术后观察兔子的饮食、前肢功能、步态及伤口愈合情况。

1.2.3.2 血清碱性磷酸酶(ALP)测定 于术前，术后2、4、8、12 周分别抽取静脉血检测ALP值。观察两组兔子血清ALP的变化，进行统计学分析。

1.2.3.3 影像学观察 术后4、8、12周行兔右桡骨X线片检查，观察骨折愈合情况；采用Lane-Sandhu X射线评分标准[5]评估骨-材料界面骨痂形成及骨愈合情况。

1.2.3.4 大体及组织学观察 术后4、8、12周处死兔子，将植入材料连同两端0.5 cm正常骨组织取出，观察桡骨骨缺损修复情况。之后将标本置于10%福尔马林中固定，经脱钙，石蜡包埋，纵行切片后，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察新生骨组织长入材料内情况及材料周围新生骨组织情况。并采用Lane-Sandhu 组织学评分标准[6]评估骨缺损修复情况。

2 结 果

2.1 一般情况 术后1h后兔子苏醒，可自由活动，但进食稍差；术后3d内所有兔子饮食均稍差，活动少；1周后兔子饮食明显增加；所有兔子术后切口均一期愈合。

2.2 血清ALP检测结果 术后2、4、8 周时各组ALP均较术前显著升高，术后2周实验组ALP值开始升高，随着时间的推移，两组ALP值均升高，术后8周达最高峰，之后开始下降，在12周时接近于术前；静脉血ALP值在术后第2、4、8周与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 影像学结果 术后第4周，实验组骨-材料界面界面模糊，可见骨痂形成，对照组材料与骨组织分界仍较清楚，有少量骨痂形成；术后第8周，实验组材料周围骨痂明显增多，材料-骨组织界面模糊，分界不清，对照组相骨痂明显较少；术后第12周，实验组和对照组均可见新生骨痂包裹材料，材料-骨组织界面模糊，实验组材料周围大量骨痂形成，量较对照组多。术后第12周Lane-SandhuX线片评分结果显示实验组(10.24±0.37)分，对照组(8.41±0.77)分，二者比较差异有统计学意义(t=2.147，P=0.037)，见表2。

表1 各组血清ALP检测结果

表2 各组Lane-Sandhu X线片评分结果，分)

2.4 组织学观察结果 术后4周，实验组材料-骨界面可见纤维骨痂、新生血管组织及骨组织，对照组在材料-骨界面可见大量纤维组织、软骨细胞及少量新生骨组织，但未见明显新生血管组织；术后8周，实验组材料-骨界面可见大量新生骨组织、新鲜松质骨及新生血管组织，对照组在材料-骨界面可见纤维组织、新生血管、骨母细胞等；术后12周，实验组可见大量板层骨形成，骨痂塑形完好，对照组在材料-骨界面可见大量新生骨组织、密质骨，见图2。术后第12周 Lane-Sandhu组织学评分结果显示实验组(11.65±0.58)分，对照组(9.33±0.26)分，二者比较差异有统计学意义(t=2.438，P=0.031)，见表3。

图2 术后12周骨-材料界面HE染色(×100)

表3 各组Lane-Sandhu组织学评分结果，分)

3 讨 论

骨缺损的修复和重建是目前骨科研究领域中的热点课题，现阶段临床上应用较为广泛的骨修复材料主要包括异体骨、自体骨和人工生物材料等。自体骨来源有限，异体骨移植可能使患者产生免疫排斥反应，也存在伦理问题和引入外源病菌、病毒的风险。这些问题与风险促使人们研制更加先进、有效的人工骨修复材料来实现骨组织缺损的再生与重建。n-HA/PA66复合骨修复材料因具有良好的生物力学性能、生物相容性及生物安全性，目前已广泛用于骨缺损的填充及修复，并取得了不错的临床效果[1,5,7]。但该材料无骨诱导作用，早期成骨效果及材料-骨界面稳定性较差[5,8]。

近年来，有学者提出将生物活性分子固定在人工合成材料表面进行修饰，为种子细胞提供黏附、增殖和分化信号的生物界面[9]。目前，使用最广泛的是含RGD序列的多肽，RGD是一类存在于多种黏附蛋白结构中的共有基序，因此将其修饰到材料表面可增强成骨细胞黏附、增殖和分化，促进hESCd-MSCs细胞黏附、增殖及骨矿物质的合成，促进植入物周边新生骨形成，增强早期成骨标志-ALP活性[10-14]。然而由于缺乏附属或调节性结构域，导致RGD肽生物活性及RGD序列的功能受限[15]。为提高生物利用度，部分学者提出在RGD序列周围圈定足够的功能位点，其中最重要的方法之一是核心基序RGD和辅助序列PHSRN的互补性修饰[16]。Lee等[3]发现EPDIM和YH互补性修饰能够促进细胞的黏附与扩散，并在此基础上进一步合成包含RGD，PHSRN，EPDIM，YH4个序列互补性修饰的T-CAM黏附分子，动物实验表明复合T-CAM黏附分子的脱钙骨有良好的修复骨缺损能力。为此，作者将T-CAM黏附分子复合到n-HA/PA66材料表面进行修饰，期望通过黏附分子表面修饰提高材料早期诱导成骨性能。

Park等[17]研究显示T-CAM表面修饰的植入材料能明显促进兔股骨植入物周边新生骨的形成。本研究结果显示，动物实验中组织学和影像学结果表明术后实验组新骨生长速度和数量明显优于对照组，显示n-HA/PA66材料经T-CAM黏附分子表面修饰后具有良好的诱导成骨效应。ALP的表达可反应软骨及骨细胞的增生、活跃程度，ALP结果提示术后2周时实验组ALP水平是术前的1.6倍，对照组ALP接近术前水平,说明实验组从术后2周开始即有成骨；4周时实验组和对照组分别是术前的2.0和1.7倍，术后8周达最高峰，实验组和对照组分别是术前的3.4和2.6倍，之后开始下降，在12周时ALP水平接近于术前。这提示材料植入后4周骨及软骨细胞增生活跃，8周时达最高峰，而T-CAM表面修饰n-HA/PA66复合骨修复材料的成骨效果优于n-HA/PA66复合材料。

综上所述，本实验结果表明，从X线片、大体标本及组织学观察，相对于n-HA/PA66复合材料，T-CAM表面修饰nHA/PA66复合骨修复材料体内具有更好的成骨特性，尤其是在愈合早期，可满足局部骨缺损的修复，具有良好的临床应用前景。

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The experimental research of T-CAM surface modification nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composite materials repair of rabbit radius bone defect*

QiuHao1,DongJing1,LuGongbiao2,LuMinpeng1△,CaoChunfeng1,WangQunbo1,ZhangMinghua1

(1.DepartmentofOrthopedics,YongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;2.DepartmentofOrthopedics,JiningFirstPeople′sHospital,Jining,Shandong272011,China)

Objective To discuss the efficacy of T-CAM surface modification nano-hydroxyapatite/polyamide 66 (T-CAM/n-HA/PA66) composite materials on the recovery of rabbit radius bone defect.Methods A total of 36 New Zealand rabbits were artificially made to be bone defect by resecting the 1.5 cm substantia ossea with periosteum of radius,and were divided into two groups averagely depending on implanted materials:experimental group (T-CAM/n-HA/PA66),control group (n-HA/PA66).The alkaline phosphatase (ALP) of venous blood was observed at preoperative and week 2,4,8,12 postoperative.Every 6 rabbits were sacrificed on week 2,4,8,12,and the radius healing status was observed by X-ray,histology.Results No rabbit was infected or died,no implant material was dropped.Gross observation，X-ray results and histology results demonstrated that the experimental group began to have a new bone tissue at 4 weeks after the operation；with the extension of time,the experimental group′s new bone growth speed and the quantity were better than the those of control group.The Lane -Sandhu method X-ray score showed that there were significant differences between two groups (P<0.05),as well as the Lane-Sandhu method histological score.The ALP value of experimental group began to rise at two weeks postoperative;with the extension of time,ALP value of both groups increased,peaked at 8 weeks,then began to decline,lastly close to the preoperative at 12 weeks,The ALP value at 2,4 and 8 weeks were significant between two groups (P<0.01).Conclusion T-CAM/n-HA/PA66 composite materials could accelerate the healing of bone defect.the effect of repair of bone defect is better than that of n-HA/PA66 artificial bone in the early.

radius；alkaline phosphatase；fracture healing；bone defect；T-CAM nano-hydroxyapatite；polyamide 66

重庆市科委自然科学基金资助项目(cstc2012jjA10029)；重庆市永川区科委基金资助项目(YCSTC，2011BE5018)。 作者简介：邱皓(1991-)，在读硕士，主要从事骨科生物材料、脊柱外科方面研究。△

E-mail：luminpeng@126.com。

论著·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.006

R

A

1671-8348(2016)23-3185-03

2016-04-02

2016-06-23)