针刺对应激性高血压前期大鼠肾脏基因表达的影响

郭骐影，孙启胜，贾文睿，郭秋蕾，杨芳媛，战 和，王 赫，刘清国

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)



·实验研究·

针刺对应激性高血压前期大鼠肾脏基因表达的影响

郭骐影，孙启胜，贾文睿，郭秋蕾，杨芳媛，战 和，王 赫，刘清国*

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

目的 以应激性高血压前期大鼠为模型，运用基因芯片技术和生物信息学分析技术，研究针刺对其肾脏基因表达的影响。方法 将9 周龄雄性 Wistar 大鼠，随机分为空白组、模型组、针刺组。模型组和针刺组运用噪声结合足底电击刺激的造摸方式，造模同时，针刺组针刺曲池穴、太冲穴进行干预，模型组和空白组每天只做与针刺组相同的抓取刺激。记录在造模前1天、第 3、5、7、9、11天大鼠的血压变化，11 d后取大鼠左肾。运用Gene Chip Rat Gene 2.0 ST芯片对应激性高血压前期模型大鼠肾组织进行基因表达谱的检测，分别找出空白组与模型组之间及模型组与针刺组之间的差异表达基因。运用GO数据库对各组间差异表达基因进行基因功能富集分析。结果 造模开始后，空白组血压基本稳定;第 3 天开始模型组血压开始上升，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)，并出现行为改变。针刺干预第 5 天开始，针刺组血压低于模型组(P<0.05)。芯片分析显示:与空白组相比，模型组共筛选出的差异表达基因有46个上调，有48个下调；与模型组相比，针刺治疗后差异表达基因有11个上调，有45个下调;基因功能富集分析显示差异基因与生物调节,刺激反应,多细胞生物体过程,代谢过程,免疫系统进程,受体活性,调节酶,转运蛋白活性等功能有关。结论 针刺太冲、曲池穴对于应激性高血压前期大鼠具有一定的降压效应，并可能通过下调Cntn4,Spta1,Mir10,Fbxo15基因来调节血压并对其早期肾脏损害有一定的保护作用。

应激性高血压;高血压前期；针灸疗法；基因芯片;肾脏

高血压一种以动脉血压持续升高为主要表现的慢性疾病，是严重危害人类健康的重大疾病之一[1]，研究[2]表明强烈的焦虑、紧张、愤怒、抑郁等负性情绪常引起的应激反应是现代社会快节奏生活导致高血压病的重要原因。在环境应激导致的血压升高过程中，自身血压高于正常血压值，但是并未达到高血压的诊断标准，称之为高血压前期。《中国高血压防治指南2010》明确指出[1]，收缩压120～139 mmHg和(或)舒张压80～89 mmHg的人群，为正常高值血压，等同为高血压前期。目前高血压已成为造成终末期肾脏病(KSRD)的主要原因之一[3]。肾脏损害的增加，会反过来升高血压，形成恶性循环。针剌疗法[4]干预高血压前期以中医理论为指导，具有操作简便、不良反应少、效果平稳等优势，而针刺干预高血压前期机制值得进一步研究[5-6]。本实验运用基因芯片技术和生物信息学分析技术，通过分析针刺对肾脏基因表达的影响，从基因层面阐释针刺降压和肾脏保护的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级，雄性Wistar大鼠，9周龄，体质量(220±30)g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)200223。整个研究过程中，控制室温在(20±1)℃，湿度50%，12 h明暗循环，自由进食及饮水。实验过程中的所有程序均遵循WHO颁布的生物医学研究中的动物实验国际伦理准则，并已得到北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 分组 根据随机数字表将36只实验用大鼠随机分成3组：空白组、模型组和针刺+模型组，每组12只。

1.3 模型制备 通过足底电击结合噪声刺激制备应激性高血压大鼠模型。将模型组和针刺+模型组大鼠放入MG-2 型迷宫刺激器(中国安徽淮北正华生物仪器有限公司生产)，迷宫刺激器笼子为(22 cm×22 cm×26 cm)的规格，笼子底部由细的铜栅构成，铜栅间隙为1.2 cm。铜栅上通以间断性交流电，给予动物足底电脉冲刺激；刺激脉冲每2～25 s之间随机发生1次，每次通电的间隔由计算机程序控制，刺激脉冲电压为30 V，每次持续时间为5 s，电流的输出无规律可循，从而增强了应激强度，使之产生高度精神及情绪上的紧张。电刺激的同时,由蜂鸣器发出噪声，80～100 db，时程50 ms。每天上午8∶00—10∶00和下午14∶00—16∶00进行造模，在同一时间段内将空白组置于相同的鼠笼，没有足底电击和噪声刺激。造模共持续11 d。1.4 干预 3组大鼠均宽松地置于暴露四肢的特制限制器中。于后肢足背1、2趾骨凹陷处取太冲穴；肘横纹外侧端，屈肘，当尺泽穴与肱骨外上髁连线中点取曲池穴。模型加针刺组：将针灸针(0.32 mm×25 mm，中国苏州针灸用品有限公司生产)分别直刺大鼠双侧太冲穴、曲池穴1.5～2.0 mm、4 mm。留针20 min。从造模第1天开始每天1次，一直持续到第11天造模结束。空白组和模型组大鼠固定在相同限制器内20 min，不接受针刺干预。所有干预均有同1人完成。

1.5 血压测量 在造模前1天以及造模第3、5、7、9、11天上午进行应激刺激前进行血压测量。在温控(22±2)℃环境中测量大鼠尾动脉收缩压。将大鼠放于36 ℃的预热箱中预热15 min后，在大鼠安静、清醒的状态下用无创血压仪测量大鼠收缩压。每只大鼠测量3次，取平均血压值。

1.6 取材 在11 d造模结束后的第2天上午8∶00，对所有大鼠进行腹膜内注射100 g/L水合氯醛(500 mg/kg)(中国北京博朗生科技有限公司提供)予以麻醉。大鼠死亡后，取肾脏放于冰块上迅速剥离包膜，用经4 ℃生理盐水清洗，干燥后放于冻存管中，再经液氮固定后于-80 ℃冰箱保存。

1.7 样品制备和微阵列芯片图像分析 使用mirVanamiRNA分离试剂盒(P/N AM1552，USA)，从独立样本中分别提取出总RNA。使用NanoDropND-1000(USA)检测总RNA质量，用Agilent 2100 bioanalysis(厂商信息)评估总RNA完整性。运用Gene Chip Rat Gene 2.0 ST Array(USA)(包括610 400个不同探针,相当于16 771个良好注释的基因)对各组的生物学样本进行微阵列分析,并重复3次。按照以下步骤对每个样本的总RNA进行标记、杂交:1)制备Poly-A RNA质控；2)合成第一链cDNA；3)合成第二链cDNA；4)合成cRNA的体外逆转录；5)合成第二轮单链cDNA；6)使用RNase H水解RNA；7)片段化和标记单链cDNA；8)使用Affymetrix GeneChip 645系统进行芯片杂交；9)使用Affymetrix GeneChip 450系统进行芯片洗染。使用Affymetrix GeneChip 7G微阵列扫描仪(Affymetrix,USA)扫描芯片。以上标记和杂交步骤均依据Affymetrix协议(GeneChip WT PLUS Reagent Kit，P/N 902280，Affymetrix，USA)执行。

1.8 数据分析 将扫描图输入到Affymetrix Expression console software中，对齐网格后对芯片图像进行数据分析。使用Affymetrix Expression console software中的Robust Multichip Average(RMA+SKETCH)算法对基因表达的数据进行归一化的处理与分析。归一化的数据将以CHP格式存放，并转化成fold-change值表示差异表达基因的倍数变化，再将其输入到Transcriptome Analysis console作进一步分析。差异表达基因的筛选标准为P<0.05,fold-change阈值为1.5,基因fold-change值大于或等于1.5都视为差异表达基因。模型组与空白组、模型+针刺组分别对照。

1.9 基因功能分析 运用Affymetrix Gene Chip Gene 2.0 ST芯片筛选组间差异表达基因，并校正各组所有基因的背景值。运用GO数据库从生物过程、细胞成分和分子功能3个层面对组间差异表达基因进行基因功能富集分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血压值变化 见表1。

mmHg

注:与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，△P<0.05

2.2 基因芯片结果 与空白组相比，模型组共简选出差异表达基因46个上调，48个下调；与模型组相比，电针治疗后有11个上调，45个下调。经统计共有3个基因在2组中的表达差异均大于1.5倍,说明有3个基因在模型制备后及电针治疗均发生显著的表达差异(fold change>1.5；P<0.05)，见表2。

表2 差异基因

2.3 GO功能富集分析 基因组注释(Genome annotation)是利用生物信息学方法和工具，对基因组所有基因的生物学功能进行高通量注释。Gene Ontology(GO)是基因本体论联合会(Gene Ontology Consortium)所建立的数据库，本研究利用该数据库将实验3组间所得到的差异表达基因在GO(http://www.gene.ontology.org)登陆,从分子功能、细胞成分、生物学途径3个层面查询并进行基因功能富集分析，发现差异基因与生物调节，刺激反应，多细胞生物体过程，代谢过程，免疫系统进程，受体活性，调节酶，转运蛋白活性等功能有关。

3 讨论

本研究采用胁迫拥挤加噪声结合足底电击的应激性刺激，将心理躯体2种方式相结合，以更好的模拟人类的接受应激刺激所造成的疾病的过程。研究[7-8]表明此动物模型在15 d时血压达到最高值，在刺激不变的情况下15～28 d内血压保持稳定。由此可以认为1～15 d是应激性动物高血压前期，15～28 d是应激性高血压的稳定期。根据应激性血压的升高规律，本实验在大鼠接受应激刺激后的第11天即高血压前期阶段，通过基因芯片技术检测出针刺干预后基因表达有显著差异的基因并查找相关的生物学功能。结果显示，应激刺激使模型组大鼠血压明显升高，并在高血压前期阶段就表现出基因的差异表达，经筛查，高血压及肾脏保护作用密切相关基因有Cntn4，Mir10，FBXO15基因。

Cntn4基因即神经细胞黏附蛋白。强关联的血清尿酸浓度的调节与CNTN4等基因的3p26区域相关[9]。石慧婧[10]发现血尿酸升高亦可增加高血压的发病风险并和早期肾功能损伤正相关；尿酸升高的早期CKD大鼠血管内皮细胞存在明显损伤，出现功能紊乱，且损伤程度与血尿酸水平成正相关[11-12]。

Mir10基因是小分子 RNA(Mirna)，通过影响稳定性和翻译的基因，参与在多细胞生物的基因表达的转录调控。内皮功能紊乱参与动脉粥样硬化的形成，被认为是心血管疾病发生的重要预测因子[13]。在治疗血管损伤性疾病过程中，损伤血管内膜再内皮化及缺血部位血管新生均起到了重要作用，内皮祖细胞具有定向参与以上2个过程的作用[14-15]。研究[17-18]表明尿 miR-10a代表新的无创、敏感、特异、潜在的高吞吐量方法可检测早期肾功能损伤。FBXO15 的调节通过泛素-蛋白酶体途径表达。研究[17]表明，泛素-蛋白酶体系统参与调节平滑肌细胞的凋亡、增殖和分化起着关键性作用。泛素连接酶基因可降低动脉血管心肌素的蛋白水平和血管平滑肌细胞标志基因的表达，调节主动脉血管收缩性。

综上，针刺干预高血压前期，可以通过调节Cntn4，Mir10，FBXO15等基因，调节血管内皮功能，血管平滑肌细胞的凋亡，血清尿酸浓度等来降低高血压的发病风险并防治早期肾功能损伤。

[1]中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南2010[J].中国医学前沿杂志(电子版),2011,3(5):42-93.

[2]PICKERING T G.Mental stress as a causal factor in the development of hypertension and cardiovascular disease[J].Current Hypertension Reports,2001,3(3):249-254.

[3]刘力生.高血压[M].2版.北京:人民卫生出版社,2001.[4]GUPTA P,NAGARAJU S P,GUPTA A,et al.Prehypertension-time to act[J].Saudi Journal of Kidney Diseases and Transplantation:an Official Publication of the Saudi Center for Organ Transplantation,Saudi Arabia,2012,23(2):223-233.

[5]李姣,张立德,曲怡.针灸治未病与高血压前期相关理论[J].实用中医内科杂志,2015,29(1):4-6.

[6]王洪彬,李晓泓,宋晓琳,等.逆针灸“溯源”[J].中华中医药学刊,2009,27(6):1205-1206.

[7]王丽,王朝阳,支建梅,等.应激性高血压大鼠模型的建立及评定[C]//第八届全国中青年针灸推拿学术研讨会论文集,西宁,2008.

[8]李福平,高凌云,肖颖彬.大鼠慢性多重应激模型的建立[J].现代生物医学进展,2008,8(1):27-29.

[9]NIKPAY M,SEDA O,TREMBLAY J,et al.Genetic mapping of habitual substance use,obesity-related traits,responses to mental and physical stress,and heart rate and blood pressure measurements reveals shared genes that are overrepresented in the neural synapse[J].Hypertension Research,2012,35(6):585-591.

[10]石慧婧.血尿酸水平与新发高血压风险的研究[D].唐山:河北联合大学,2014.

[11]王昱.尿酸在早期CKD血管内皮损伤中的作用及其机制的研究[D].上海:复旦大学,2008.

[12]CHITTOOR G,KENT J,ALMEIDA M,et al.GWAS and transcriptional analysis prioritize ITPR1 and CNTN4 for a serum uric acid 3p26 QTL in Mexican Americans[J].BMC Genomics,2016,17(1):276.

[13]罗晓佳.血管内皮细胞损伤与高血压[J].心血管病学进展,2010,31(4):573-577.

[14]贺爽,郭浩,徐砚通,等.中药促进内皮祖细胞功能治疗血管损伤性疾病的研究进展[J].中华中医药杂志,2013,28(12):3612-3619.

[15]ZHU Shoukang,DENG Shanming,MA Qi,et al.MicroRNA-10A and MicroRNA-21 modulate endothelial progenitor cell senescence via suppressing high-mobility group A2[J].Circulation Research,2013,112(1):152-164.[16]WANG Nan,ZHOU Yang,JIANG Lei,et al.Urinary MicroRNA-10a and MicroRNA-30d serve as novel,sensitive and specific biomarkers for kidney injury[J].PLOS One,2012,7(12):51140.

[17]范永娜.泛素-蛋白酶体系统调节血管平滑肌细胞凋亡和表型转换的机理研究[D].北京:北京协和医学院，中国医学科学院，北京协和医学院，清华大学医学部，中国医学科学院,2009.

[18]KATAYAMA K,NOGUCHIANDY K.Sugimoto,FBXO15 regulates P-glycoprotein/ABCB1 expression through the ubiquitin-proteasome pathway in cancer cells[J].Cancer Science,2013,104(6):694-702.

Acupuncture treating gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rats

GUO Qiying,SUN Qisheng,JIA Wenrui,GUO Qiulei,YANG Fangyuan,ZHAN He,WANG He,LIU Qingguo*

(School of Acupuncture and Massage,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Objective To use gene chip technology and bioinformatics technologies,study the effects of acupuncture on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rat.Methods The 9-week-old male Wistar rats were randomly divided into blank group,model group,and acupuncture group.Model group and acupuncture group using noise combined with foot shock to stimulate touch,at the same time,the acupuncture group was applied to bilateral “Taichong”(LR3) and Quchi(LI11) for 20 min.The model control and blank control group rats were grabbed in the same restrainers for 20min without any other intervene.Recorded in model 1 day before,3 th 5 th 7 th 9 th 11th day rats blood pressure changes,after 11 days,draw left kidney materials of rats and use Gene Chip Rat Gene 2.0 ST chips analysed the differentially expressed genes between the blank group and model group,model group and acupuncture group.Using the differentially expressed genes between groups for enrichment of gene function analysis by GO database.Results The model began,the blank group blood pressure remain stable;3rd day of model group blood pressure begins to rise,significant differences compared with the normal group (P<0.01),and behavioural change.5th day the acupuncture group blood pressure lower than the model group (P<0.05).Microarray analysis showed that compared with the blank group,model group of the differentially expressed genes screened out 46 increases 48 reduced,after acupuncture treatment there are 11 increase and 45 down of differentially expressed genes;Enrichment of gene function analysis revealed differences in biological regulation,response to stimulus,genetic and biological regulation,multicellular organismal process,metabolic process,immune system process,enzyme regulator activity,transporter activity and other function.Conclusion Acupuncture at Taichong and Quchi can lower the SBP of stress-induced pre-hypertension rats and possibly through down the genes Cntn4,Spta1,Mir10a,Fbxo15 to regulation blood pressure and protect kidney.

stress-induced hypertension;pre-hypertension;acupuncture;gene chip;kidney

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.005

国家自然科学基金“基于系统生物学的针刺对应激性前期高血压的调控机制与干预靶点的研究” (81373727)。

郭骐影(1990-)，女，硕士研究生，主要从事针灸临床及机理研究。

R245

A

2095-6258(2016)06-1112-04

2016-08-10)

*通信作者：刘清国，男，教授，电话-13691517881，电子信箱-liuqingguo999@vip.sina.cn