大鼠孕期PFOS染毒对亲代及子一代怀孕情况及生殖器官病理影响的研究

周洪媛 邓冰 范霞林 王加好 李虹

(贵州医科大学医学心理学教研室,贵州 贵阳 550004)



·论 著·

大鼠孕期PFOS染毒对亲代及子一代怀孕情况及生殖器官病理影响的研究

周洪媛 邓冰△范霞林 王加好 李虹

(贵州医科大学医学心理学教研室,贵州 贵阳 550004)

目的 评价孕期(gestational day，GD)大鼠全氟辛烷磺酸(PFOS)染毒后对亲代及子代大鼠怀孕率、怀孕周期的影响。方法 将120只雌鼠、40只雄鼠分别按体质量随机各分为四组，灌胃染毒孕期大鼠。对照组:2%Tween-80即PFOS 0 mg/(kg·d);低浓度组:PFOS 0.4 mg/(kg·d);中浓度组:0.8 mg/(kg·d);高浓度组:1.6 mg/(kg·d)。哺乳期停止染毒。合笼后的喂养过程中记录各组亲代大鼠怀孕只数，怀孕周期。哺乳结束时，髂静脉放血处死亲代大鼠及部分子代大鼠(每窝子代留下2只雌鼠，1只雄鼠)，取生殖器官观察病理改变，子代大鼠不再染毒，喂养至2个月时，雌雄合笼1周，记录各组子代雌鼠的怀孕率、怀孕周期。实验结果采用χ2检验、Kruskal-Wallis秩和检验进行统计分析。结果 亲代大鼠怀孕率各组间无差异，亲代大鼠怀孕周期中、高浓度组有所延长;子代大鼠怀孕率中、高浓度组低于对照组，子代大鼠怀孕周期三个实验组均延长;亲代大鼠卵巢四个组均有病理改变;子代大鼠卵巢三个实验组发生病理改变，中剂量组睾丸有1例发育异常。结论 孕期全氟辛烷磺酸会对亲代大鼠的怀孕周期和子代大鼠怀孕率及怀孕周期造成影响，并能引起亲代及子代生殖器官的病理改变。

孕期大鼠; 全氟辛烷磺酸; 怀孕情况; 生殖器官; 病理改变

全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulfonate，PFOS)是一类重要的全氟化合物，是其他全氟类化合物的主要代谢产物，其化学结构中含有高键能的“碳—氟”键，不容易受到外界作用而产生断裂[1]。因此，PFOS的性质相当稳定，在自然环境中不易分解，同时，PFOS还具有高疏水、疏油的特性，被广泛应用于日常生活中[2]。PFOS具有高生物蓄积性，也能通过胎盘屏障[3]，存在于乳汁中[4-5]，PFOS 对生物体具有生殖发育毒性、遗传毒性、肝脏毒性、神经毒性，发育毒性等[6-7]。本课题旨在研究孕期PFOS染毒后对亲代及子代怀孕情况的影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂 试剂PFOS(纯度≥98%)购于Sigma公司(美国)。配制2%Tween-80溶液，按照实验设计剂量加入全氟辛烷磺酸钾(PFOS-K)配制PFOS溶液。再根据大鼠体质量重量计算PFOS溶液用量。

1.2 实验动物及染毒情况 清洁级成年SD大鼠。雌鼠120只，体质量175～290 g，雄鼠40只，体质量290～365 g。按体质量随机分为四组，每组40只，其中雌鼠30只，雄鼠10只。适应性喂养1周后，合笼1周，处死雄鼠。从合笼1 d至孕期(gestational day，GD)结束按大鼠体质量及组别，对照组2%tween-80即PFOS 0 mg/(kg·d)、低浓度组PFOS 0.4 mg/(kg·d)、中浓度组PFOS 0.8 mg/(kg·d)、高浓度组PFOS 1.6 mg/(kg·d)每天灌胃染毒孕期大鼠。大鼠自由进水、进食，室内温度控制在20～25 ℃，相对湿度40%～60%。照明为普通灯光，12 h明亮，12 h黑暗。染毒时每天根据孕鼠的体质量随时调整灌胃的剂量。于合笼15 d时筛选出未怀孕的大鼠，哺乳期(postnatalday，PD)停止染毒。

1.3 动物处理方法 亲代大鼠合笼后，处死雄鼠，雌鼠在喂养的过程中，记录亲代大鼠的怀孕数、孕周时间，哺乳结束即哺乳满1个月时髂静脉取血后处死所有亲代大鼠及部份子代大鼠(每窝子代留下2只雌鼠、1只雄鼠)，每组随机取6只亲代卵巢、子宫及子代卵巢、子宫、睾丸，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片为4 μm，HE染色，显微镜(×100)观察其病理改变。子代大鼠喂养过程中不染毒，喂养至2个月时，雌雄合笼1周，记录子代雌性大鼠怀孕数、孕周时间。

1.4 统计学方法 全部数据分析均采用SPSS18.0统计软件。组间大鼠怀孕率的比较用χ2检验，检验水准α=0.05。P≤0.05时，进行χ2分割，各组间两两比较。怀孕周期长短用Kruskal-Wallis秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 亲代大鼠的怀孕率 怀孕率的计算方法:怀孕率=各组怀孕只数÷各组总数%。对照组27只，怀孕20只( 74. 0% );低剂量组29只，怀孕18只(62.1%);中剂量组27只，怀孕22只(81.5%);高剂量组27只，怀孕15只(55.6%);经检验，亲代各组怀孕率差异无统计学意义(χ2=5.117，P=0.163)。见表1。

表1 亲代大鼠孕期PFOS染毒对亲代及子一代怀孕情况的影响

注:与对照组比较，*P<0.05。

2.2 亲代大鼠的孕周期 怀孕周期为大鼠合笼后检查阴栓确定怀孕为第1天，至分娩产仔的天数。记录各组大鼠孕周期天数，经Kruskal-Wallis秩和检验，差异有统计学意义(χ2=10.828，P=0.013)，结合表2，中浓度组和高浓度组孕期有所延长，而低浓度组的孕期没有受到影响。

2.3 亲代生殖器官病理改变情况 卵巢组织切片发现各组都有不同程度的卵泡细胞数量减少、闭锁卵泡增多、黄体形成增加。子宫腔都有不同程度的扩张。见图1。

图1 孕期大鼠全氟辛烷磺酸(PFOS)染毒后亲代大鼠卵巢病理学改变(×100)

2.4 子代大鼠的怀孕率 对照组11只，怀孕9只(81.8%);低剂量组12只，怀孕4只(33.3%);中剂量组13只，怀孕2只(30.8%);高剂量组11只，怀孕3只(27.3%)。经检验，子代各组怀孕率差异有统计学意义(χ2=8.751，P=0.027)。进一步进行χ2分割，对照组与实验组比较时，对照组的怀孕率高于中浓度组与高浓度组(P<0.05)，对照组与低浓度组怀孕率差异无统计学意义(P=0.678);实验组间比较时，各组间怀孕率差异无统计学意义。见表1。

2.5 子代大鼠的孕周期经Kruskal-Wallis秩和检验，P=0.009，各组差异有统计学意义，且三个实验组的孕周期较对照组都有所延长，其余组间比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 亲代孕期PFOS染毒对亲代及子一代怀孕周期的影响(M±Q)

注:与对照组比较，*P<0.05。

2.6 子代生殖器官病理改变 子代卵巢组织切片中，对照组卵巢组织结构正常，不同发育阶段卵泡大小、形态、数量、分布正常，黄体形成正常，未见变性、坏死等病理改变；而三个实验组的卵巢不同发育阶段卵泡都有不同程度的数量增多，黄体数量减少，未见其他病变。中浓度组1例睾丸发育轻度异常，曲精小管大小、形态、数量、排列及发育轻度不良，各级生精上皮发育、分化轻度不良；其余各组未见睾丸异常情况。见图2、图3。

3 讨 论

本实验中，亲代大鼠各组间怀孕率差异无统计学意义，是由于染毒从合笼第1天开始的，而此时大鼠已经基本怀孕，同时由于早期体内蓄积的PFOS的量有限，即使在染毒后的前几天怀孕，其对大鼠的影响也不是很明显，所以亲代大鼠怀孕率没有受到明显的影响。子代的怀孕率，对照组高于中浓度组和高浓度组，对照组和低浓度组的怀孕率没有差异。与亲代怀孕率相比，子代的怀孕率，对照组增高了7.7%，其余3个组分别降低了29%、50.7%、28.3%。亲代大鼠时，由于在孕早期PFOS量非常有限，对亲代大鼠的影响还不是很明显，而在子代大鼠，怀孕前子代大鼠就已经蓄积了从母体获得的一定剂量的PFOS，对其生殖功能产生了影响，从而使三个实验组的子代大鼠怀孕率有所下降，且中、高浓度组体内的量相对较高，影响也较明显。虽然在亲代我们没有发现PFOS对亲代生殖有明显的影响，但是，在子代，这种生殖毒性的影响却比较突出，说明PFOS的生殖毒性，不仅仅局限于受PFOS染毒的亲代大鼠，还因为PFOS能够通过亲代传给子代，并在子代的体内蓄积对子代生殖产生影响，从而导致其子代的生育能力降低。这与文永霞[8]等研究指出新生发育期PFOS慢性染毒能引起雌性大鼠的生长发育迟缓，并致成年时生育力下降，不孕不育，该生殖毒性可遗传子代的结果类似。

亲代大鼠孕期在中浓度组和高浓度组有所延长，而低浓度组的孕期没有受到影响，说明PFOS达到一定剂量浓度时，可对大鼠的孕期长短造成一定的影响。子代大鼠的孕期，三个实验组的孕期比对照组都有所延长。这与D.J.Luebker[9]报道的通过每天0.8 mg/kg的PFOS和更高剂量PFOS的污染暴露，小鼠分娩时间明显缩短有些矛盾，但是同样能说明PFOS可使鼠的孕期受到影响。但是，PFOS对实验动物孕期长短的影响是否受种属差异的影响有待进一步证实。

亲代各组大鼠子宫都出现了一定程度的扩张，可能是由于产仔后子宫复旧不全引起。对照组与各实验组都有不同程度的卵细胞数量减少、闭锁卵泡增多、黄体形成减少，是由于产后体内激素水平的降低，或是由于PFOS的生殖毒性引起，还有待进一步的研究。在子一代大鼠，中浓度组发现了1例睾丸发育轻度异常，主要表现为曲细精管大小、形态、数量、排列及发育轻度不良，各级生精上皮发育、分化轻度不良。张小梅等[10]通过对雄鹌鹑的PFOS染毒实验发现，由于受到生精细胞脱落、生精上皮变薄、支持细胞数量减少的影响，导致PFOS 染毒组雄鹌鹑睾丸组织中生精细胞的营养供给不足，使生精细胞发育停滞。这些机制可能是出现上述结果的原因，说明PFOS感染后对睾丸的发育有一定的影响。同时三个实验组的卵巢都有不同程度的卵泡数量增多，黄体数量减少，而对照组没有发现此改变。王晓彤[11]等研究指出:出生后8 h的斑马鱼胚胎开始暴露于250 μg/L的PFOS中直至受精后150 d，表现出了明显的生殖毒性，体内性激素的水平也发生了显著性的改变，不论在雌鱼还是雄鱼，雌二醇的水平都是升高的，睾酮的水平都是降低的，并且在雄鱼体内睾酮的降低和雌二醇的升高都出现了统计学上的差异，这说明PFOS对生殖毒性的影响主要是通过影响体内激素水平来发挥作用的。虽然本研究三个实验组的子一代的卵泡数量有不同程度的增加，而由于其黄体数量的减少，其生殖能力反而下降了，这可能也是引起本次实验中实验组怀孕率降低的原因。

本次实验中，孕期大鼠PFOS暴露后对大鼠的怀孕率、怀孕周期长短都有一定的影响，并能引起生殖器官的病理改变，而且这种影响不仅仅局限在亲代大鼠中，对未进行直接染毒的子代大鼠怀孕情况及生殖器官也有明显的影响，子代大鼠实验组的怀孕率、怀孕周期均有所下降和延长，卵巢及睾丸发生病理改变。因此，在日程生活中，我们应注重妇幼保健，尽量减少孕期的PFOS暴露，从而避免PFOS对自身及子代生殖能力造成的不良影响。

(本文图2～3见封三)

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[10] 张小梅，宋锦兰，金一和，等.全氟辛烷磺酸对雄性鹌鹑生殖毒性影响[J].生态毒理学报，2011，6(2):143-148.

[11] 王晓彤.PFOS的雌激素效应及其对斑马鱼生殖毒性的研究[D].温州医学院，2012.

Study on the ParentalAnd Offspring's Pregnancies And The Pathological Changes Of Reproductive organs After Mother Female Rate Exposure To Perfluorooctane Sulfonate (PFOS)

ZhouHongyuan,DengBing,FanXialin,WangJiahao,LiHong.

DepartmentofMedicalPsychology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To evaluate the parental female and the female offspring’s pregnancy rate and the pregnancy period after parental female rats exposed to perfluorooctane sulfonate (PFOS) in Gestational days. Methods 120 female rats, 40 male rats were randomly divided into 4 groups. After being fed for 1 week, male and female rats mated for 1 week, then killed the male rats. From the first mated day to pregnancy day ended , with different doses of PFOS (the control group:2%-Tween80 that is PFOS 0.0 mg/ (kg·d), the low concentration group:0.4 mg/(kg·d), the medium concentration group:0.8 mg/(kg·d), the high concentration group:PFOS 1.6 mg/(kg·d)) to fed the pregnant rats everyday by gavage. And stoped feeding PFOS until lactation (Postnatal day, PND ), recorded the number of parental pregnancy and the period of parental pregnancy. At the end of lactation (breast-feeding for 1 month ), killed all the parental rats and 2 offspring rats ( reserving 1 male and 2 females each generation) by iliac vein bleeding. It was observed the pathological changes of reproductive organs. The offsprings were not fed PFOS, when two-monthes old, males and females mated 1 week. That recorded the female offspring’s pregnancy rate and the pregnancy period. The results above usedχ2test and Kruskal-Wallis test for statistical analysis. Results The parental female’spregnancy rates there were no statistical significantly differences between each group. The parental female’s pregnancy periods of the medium concentration group and the high concentration group were longer than other groups. The offspring female’s pregnancy rate of the medium concentration group and the high concentration group were lower than the control group. The offspring female’s pregnancy period of all the experimental group were longer than the control group. The ovary of four groups’parental rats had pathological changes. The ovary of four groups’offspring rats had pathological changes. And the middle dose group had one testes dysplasia. Conclusion The parental females exposed PFOS during the pregnancy will affect the pregnancy rates and the pregnancy periods of both the parental females and the offsprings females.

Pregnancy rats； PFOS； Pregnancies； Reproductive organs； Pathological changes

国家自然科学基金项目(81260429)

R-332

A

1000-744X(2016)11-1123-03

2016-06-16)

△通信作者，E-mail:db-527@163.com