荧光衍生化法测定蛋清和牛奶中的磺胺药物残留

邓樱花， 李政青， 苏明伟， 陈功轩

(湖北第二师范学院 化学与生命科学学院， 武汉 430205)



荧光衍生化法测定蛋清和牛奶中的磺胺药物残留

邓樱花*， 李政青， 苏明伟， 陈功轩

(湖北第二师范学院 化学与生命科学学院， 武汉 430205)

以邻苯二甲醛为衍生试剂，建立了荧光分光光度法测定食品中磺胺残留的方法.在酸性条件下邻苯二甲醛与磺胺二甲基嘧啶反应完全，生成稳定的荧光衍生物.在最优化的条件下，磺胺二甲基嘧啶的浓度在5×10-7～1.8×10-5mol/L范围内呈线性关系，检出限为1×10-8mol/L (S/N=3).该方法用于蛋清和牛奶中磺胺药物残留的测定.

磺胺; 邻苯二甲醛; 荧光分光光度法; 衍生; 蛋清; 牛奶

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，因为这类药物具有抗菌效果好、价格便宜的优点，而被广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病[1-2].

磺胺二甲嘧啶(SM2)是兽医临床常用的一种磺胺类药物，常用作饲料添加剂，也常用于防治畜禽菌源性感染症和球虫病.由于SM2在体内作用时间和代谢时间较长，通过任何途径被人摄入后都有可能在人体中形成蓄积，当蓄积浓度超过一定值时，会对人体产生伤害.人在短期大剂量的摄入SM2会引起急性中毒，长时间小剂量的刺激则会引起慢性中毒，造成机体的泌尿系统、中枢神经系统、免疫系统被损伤，肾脏、肝脏发生不良反应，甲状腺肿大等后果，严重可能会诱发人的甲状腺癌，肝坏死等[3-5].

在我国，因为磺胺类兽药的滥用，SM2 的残留现象极其严重[6].磺胺类药物严禁用于产蛋鸡，但是其不合理使用现象十分严重，其残留问题引起了世界各国的重视.欧盟、美国、加拿大等国家规定了动物组织中磺胺类药物最大残留量是100 μg/kg[7]，我国也规定磺胺类药物的总残留量不能超过100 μg/kg[8].

目前，磺胺类药物的残留检测方法主要有酶联免疫方法[9]、循环伏安法[10]、高效液相色谱法[11]、气质联用法[6]、液质联用法[12]、毛细管电泳法[13]、荧光分析法[14]等.荧光分析法具有快速、灵敏、操作简单等优点，近年来得到了快速发展，在磺胺类药物中的应用也越来越广泛.

本文采用邻苯二甲醛(OPA)作为荧光衍生试剂，建立了荧光分光光度法测定磺胺二甲基嘧啶的分析方法，对衍生条件(包括溶液的pH、OPA的用量、衍生时间和温度等)作了详细的优化.并将所建立的方法应用于蛋清和牛奶中磺胺药物的残留分析.

1实验部分

1.1试剂和仪器

磺胺二甲基嘧啶购于Adamas Reagent Co. Ltd，邻苯二甲醛(OPA)和乙腈购于Sigma-Aldrich，冰乙酸、磷酸、硼酸、甲醇、氢氧化钠、无水乙酸钠、无水乙醇和无水硫酸镁均是分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司.

LS55荧光仪(美国Perkin Elmer公司)，FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)，ME104E电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司).

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制 OPA溶液：准确称取0.001 g的OPA固体，使其完全溶解于1 mL的甲醇溶液中，得到7.46×10-3mol/L OPA的储备液，每天配制新鲜溶液.

磺胺二甲基嘧啶储备液：准确称取0.027 8 g的磺胺二甲基嘧啶溶于10 mL甲醇溶液，即配得1×10-2mol/L的标准储备液，避光保存在4℃冰箱中.

三酸混合液：在0.4 mol/L的三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸)中加入一定体积的2 mol/L的NaOH或者1 mol/L的HCl溶液，依次调节pH 值至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、7.0和10.0.

1.2.2样品的预处理 本实验所用牛奶样品购自当地超市，鸡蛋购自当地市场.取5.0 mL牛奶样品并加入0.5 g 无水硫酸镁，0.2 g 无水乙酸钠和2 mL乙腈除蛋白，混匀后于4 000 r/min离心15 min，将上清液移至干净的试管按照上述方法重复再处理一次，收集处理后的上清液用超纯水定容到5 mL备用[15].

准确称取5.0 g蛋清样品，加入20 mL 80%乙醇水溶液混匀后，超声振荡30 min，然后3 000 r/min离心 3 min，离心后用移液管移取上清液 5 mL，用超纯水稀释并定容至50 mL，然后用玻璃微纤维滤纸过滤，收集滤液于干净烧杯中[16].

1.2.3磺胺的衍生过程 取1 mL 1×10-6mol/L的磺胺二甲基嘧啶标准储备液于比色管中，然后加入750 μL pH=1.5的三酸混合液，再加入200 μL的OPA溶液，用超纯水定容至5 mL，混合均匀后，在80℃的水浴中反应50 min后取出并冷却至室温，保存备用.OPA与磺胺二甲基嘧啶反应如图1所示.

图1 磺胺二甲基嘧啶与OPA的衍生反应Fig.1 The derivatization of sulfamethazine and OPA

1.2.4仪器测定条件 荧光池1 cm×1 cm， 激发和发射波长为292 nm和430 nm， 激发狭缝和发射狭缝宽度均为5 nm.

2结果与讨论

2.1荧光光谱

实验考察了以λex=292 nm 波长光激发， 磺胺二甲基嘧啶(SM2)溶液、OPA溶液、SM2与OPA反应后溶液的荧光强度，如图2所示.SM2溶液和OPA溶液几乎不产生荧光，但是两者反应后，产物在430 nm处产生很强荧光峰，这是因为两者反应后形成具有强荧光的异吲哚衍生物.

A：SM2与OPA的衍生物， B：SM2， C：OPA 图2 荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectraA: The derivative of SM2 and OPA, B:SM2, C:OPA.

2.2衍生反应条件的探究

2.2.1pH值的影响 大量文献报道OPA与氨基酸的衍生反应在碱性条件下进行.为探究pH值对OPA与磺胺的衍生反应的影响，分别用不同pH值的三酸混合液 (pH 3.0、pH 7.0、pH 10.0)作为反应条件.实验表明，当pH值为7.0和10.0时， 荧光强度非常弱; pH值为3.0时， 荧光强度增加比较明显.为了继续选择最佳pH值，选用酸性范围三酸混合液(pH 1.0～4.0)来探究pH值对衍生反应的影响，通过实验发现pH值对反应体系的荧光强度的影响较大，结果见图3A.由图3A可知在pH=1.5时体系的荧光最强，荧光强度达到最大值，后续实验中选择pH=1.5为磺胺衍生反应的最佳酸度.

图3 pH值(A)和OPA的体积(B)对荧光强度的影响Fig.3 Effect of pH value (A) and OPA volume (B) on the fluorescence intensity

2.2.2OPA用量的影响 在1 mL 1×10-6mol/L的磺胺二甲基嘧啶溶液中，分别加入50、100、150、200、250、300、350 μL OPA溶液(7.46×10-3mol /L)，考查OPA体积对衍生产物荧光强度的影响，结果见图3B所示.由图可知，随着OPA用量的增大，荧光强度逐渐增强，当OPA的体积为200 μL时，体系荧光达到最大值，并趋于稳定不再上升，故后续实验中选择加入OPA溶液的体积为200 μL.

2.2.3衍生时间的影响 按照实验方法，在1 mL 1×10-6mol/L的磺胺二甲基嘧啶溶液中，加入200 μL OPA溶液，选择反应时间在10～70 min内，考察衍生时间对体系荧光强度的影响.从图4A可见，当衍生时间达到50 min时效果最好，故后续实验选择50 min作为最佳衍生时间.

图4 衍生时间(A)和反应温度(B)对荧光强度的影响Fig.4 Effect of derivatization time (A) and reaction temperature (B) on the fluorescence intensity

2.2.4反应温度对实验的影响 温度也是影响反应的一个重要因素，在其他实验条件确定的情况下，探究温度对衍生反应后体系的荧光强度的影响，结果如图4B所示.随着温度的升高，在一定范围内荧光强度逐渐增强，在80 ℃达到最大；当温度继续升高时，荧光强度有所下降，故在本实验中选择80 ℃作为最佳衍生温度.

2.3方法学考察

2.3.1标准工作曲线和检出限 准确配制一系列不同浓度的SM2标准溶液，在优化条件下测定不同浓度溶液的荧光强度.实验表明，当SM2浓度在5×10-7～1.8×10-5mol/L范围内时，其浓度与荧光强度呈现良好的线性关系，即y=4×107x+42.449，相关系数(R2)等于 0.999 2，信噪比(S/N)等于3时，检出限为1×10-8mol/L.对1×10-6mol/L的SM2溶液进行7次重复试验，其相对标准偏差(RSD)为1.70%，表明该方法具有较好的精密度.

2.3.2样品分析 运用此荧光分析法对两种不同鸡蛋的蛋清和两种不同品牌的牛奶样品中的磺胺进行了测定，并同时做样品加标回收率实验，结果如表1 所示.

表1 分析样品结果

ND：not detected．

结果表明，本实验中分析的两种蛋清和两个不同品牌的牛奶中均没有检测到磺胺残留，此结果与文献报道相符[17-19]，也说明这些食品在磺胺类药物残留方面是安全的.实际样品中的加标回收率范围是93.07%～105.9%，相对标准偏差范围是1.09%～4.08%，小于5%.说明本方法准确度高，精密度好.

3结论

本文采用性能优良的衍生试剂OPA与SM2反应，建立了荧光分析磺胺药物残留的分析方法，该方法的线性范围为5×10-7～1.8×10-5mol/L，检出限为1×10-8 mol/L，用于分析蛋清和牛奶中磺胺残留，回收率在93.07%～105.9% 之间，相对标准偏差小于5%.说明该方法具有操作简单、灵敏度高、精密度和准确度好等优点，可作为动物源食品中检测磺胺类药物残留的快速灵敏分析方法.

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Determination of sulfonamide residues in egg white and milk by fluorescence derivatization

DENG Yinghua， LI Zhengqing， SU Mingwei， CHEN Gongxuan

(Department of Chemistry and Life Science， Hubei University of Education， Wuhan 430205)

By usingo-phthalaldehyde as a derivatization reagent， a fluorescent spectrophotometry method was developed to detect sulfonamide residues in food. The results indicated that under acidic condition，o-phthalaldehyde reacted completely with sulfamethazine and generated stable fluorescent derivatives. Under the optimal conditions， the linearity for sulfanilamide dimethyl pyrimidine ranged from 5×10-7to 1.8×10-5mol/L， with a detection limit of 1×10-8mol/L (S/N=3). The developed method was applied to analyzing sulfonamide residues in egg white and milk．

sulfonamide;o-phthalaldehyde; fluorescent spectrophotometry; derivatization; egg white; milk

2016-06-21.

湖北省科技厅项目(2014CFB565).

1000-1190(2016)06-0875-05

O657.3

A

*E-mail: dengyinghua@hue.edu.cn.