高效液相色谱法测定Cu(ATSM)混悬剂的含量

仇丽颖，罗 瑶，潘红艳

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西医院再生医学研究中心，四川 成都 610041)

高效液相色谱法测定Cu(ATSM)混悬剂的含量

仇丽颖1，2，罗 瑶1，潘红艳1

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西医院再生医学研究中心，四川 成都 610041)

目的建立测定Cu(ATSM)混悬剂中Cu(ATSM)含量的高效液相色谱法.方法采用RP-HPLC法，用ODS柱，乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)的梯度洗脱系统，检测波长为305 nm.结果Cu(ATSM)在浓度为5～100 μg·mLˉ1范围内线性关系良好(r＝0.9967)，检测限为2 ng(S/N＝3)，加样回收率为103.0%，RSD为1.98%(n＝6).结论所建方法简便，灵敏度高，准确度好，专属性强，可为Cu(ATSM)制剂的质量评价提供可行的方法参考.

高效液相色谱法；铜；铜-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)

少数民族医药擅长使用金属元素，尤其以藏药极具代表性[1-4].很多临床观察和动物试验已经证明金属元素铜在心脑血管系统中具有重要作用[5-8].在饮食中补充适量的铜可以逆转病理性心肌肥大[9]，改善心脏收缩功能[10].然而无机态的铜体内利用率不高，过量使用会引起铜中毒，而有机态铜在机体吸收利用及降低毒性方面都比无机态铜元素更具有优势.铜-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)[Cu(ATSM)，化学结构见图1，是一种含铜络合物，因其具有在缺氧组织中特异性富集的特点，最早作为正电子发射断层显像剂，被用于心肌缺氧[11]、肿瘤[12]以及卒中样脑病[13]的检测.1994年，Wada等[14]发现该化合物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤具有良好的保护作用.近年，Hung等[15]将Cu(ATSM)应用于4种帕金森动物模型，发现其具有保护神经，提高运动和认知功能，减少黑质细胞的丢失，增加多巴胺代谢等作用.鉴于其市场前景，本文建立了一种高效液相色谱法测定Cu (ATSM)混悬剂含量的方法，并对该方法进行了方法学考察.该法简便，准确可靠，可为Cu(ATSM)制剂的质量控制提供可行的参考.

图1 分子结构式Fig.1 Molecular structural formula of Cu(ATSM)

1 试药与仪器

1.1 试药

Cu(ATSM)混悬剂(批号:2015122902，2015122903，2015122904，规格:60 mg/10mL，四川大学华西医院再生医学研究中心制备)；Cu(ATSM)原料药(批号:20151101，四川大学华西医院再生医学研究中心制备).Cu(ATSM)对照品(美国Sigma公司，含量≥98%)；水为超纯水；乙腈为色谱纯；三氟乙酸为色谱纯；其它试剂均为分析纯.

1.2 仪器

1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦)；色谱柱为C18柱(Thermo，250×4.6 mm，5 μm)，预备柱(phenomenex，分析型KJO-4282).

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基键合硅胶为填充剂；乙腈-水(0.1%三氟乙酸)(梯度洗脱，0～20 min，20:80～0:100)为流动相；检测波长305 nm；流速1.0 mL/min，柱温为27℃.理论塔板数按Cu(ATSM)峰计算应不低于20000.Cu(ATSM)峰与相邻杂质峰的分离度应符合药典要求.

2.2 溶液的配制

供试品品溶液:Cu(ATSM)混悬剂取样前摇匀，精密量取0.2 mL，置50 mL量瓶中，以50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为溶剂溶解并定容，摇匀，即得.

对照品溶液:另取Cu(ATSM)对照品适量，精密称定，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解并定量稀释制成25 μg·mLˉ1的对照品溶液.

阴性对照溶液:除不加Cu(ATSM)外，其他辅料按制剂处方工艺制得空白制剂.取适量，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解(与供试品溶液浓度相当)，即得.

2.3 线性关系及范围

取Cu(ATSM)对照品适量，精密称定，以50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)为溶剂，制成含Cu(ATSM)5、10、25、50、100 μg·mLˉ1的对照品溶液，进样20 μL.以峰面积对Cu(ATSM)的浓度进行线性回归，得回归方程为:Y＝65.54X-358.23，(r＝0.9967)，即Cu (ATSM)浓度X与峰面积Y在5～100 μg·mLˉ1范围内线性关系良好.检测限为2 ng(S/N＝3，n＝3)，定量限为5 μg·mLˉ1.

2.4 专属性考察

分别取“2.2”项下的空白辅料溶液、Cu(ATSM)供试品溶液、对照品溶液各进样20 μL，记录色谱图(图2).结果空白辅料在Cu(ATSM)峰处无干扰，Cu (ATSM)与相邻杂质峰的分离度符合《中国药典》要求.

图2 Cu(ATSM)混悬剂的阴性对照(A)、对照品(B)及供试品(C)色谱图Fig.2 Chromatograms of negtive control(A)，reference substance(B)and sample(C)

2.5 精密度试验

25 μg·mLˉ1的Cu(ATSM)对照品溶液，进样体积为20 μL，重复进样5次，峰面积的RSD为0.083% (n＝5).

2.6 重复性试验

取同一批样品(批号:2015122902)，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，进样20 μL，按外标法测定含量(标示量%)，结果测得平均含量为100.3%，RSD＝1.82%(n＝6).

2.7 回收试验

于空白辅料中加入一定量的Cu(ATSM)对照品，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶液制成25 μg· mLˉ1的溶液，平行制备6份，进样20 μL，按外标法测定含量，计算平均回收率为103.0%，RSD＝1.98%.

2.8 供试品溶液稳定性考察

按“2.2”项下方法制备供试品溶液(批号: 2015122902)，置室温下于不同时间(1、2、3、5、7、9 h)分别进样20 μL，结果峰面积的RSD＝0.11%，表明供试品溶液在9 h内稳定.

2.9 样品含量测定

3批制剂按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算混悬剂中Cu(ATSM)的标示百分含量，结果3批样品含量分别为96.4%、96.2%和98.6%.

3 讨论

本文在流动相条件筛选过程中发现，采用等度洗脱时，杂质峰个数较少，可能杂质峰被主峰掩盖或保留在色谱柱上而未洗脱出来，故尝试梯度洗脱系统，以20%乙腈开始洗脱，20 min内线性上升到100%乙腈，能将主峰前后的主要杂质峰全部洗脱出来，杂质峰个数最多，并且Cu(ATSM)峰保留时间适宜，主峰的理论塔板数和拖尾因子，以及与相邻杂质峰分离度符合药典规定，能满足定量分析的要求.

本文在样品溶剂选择方面，首先选择对Cu (ATSM)具有较好溶解性的乙腈作为溶剂制备供试品以及对照品溶液，结果进样量较小(5 μL)时，Cu (ATSM)峰对称因子能达到系统适用性试验要求，而增加至20 μL后出现比较严重的前延峰.同时，实验发现在本法线性范围内，当进样体积相同(5 μL)时，Cu(ATSM)不同进样量对其柱效影响不大，这表明柱效降低的现象不是因色谱柱超载问题产生的，可能是溶剂与流动相极性不匹配造成的，因此本文尝试在溶剂中加入一定比例的水(含0.1%三氟乙酸)，通过比较保留时间，对称因子，以及峰形，筛选出乙腈:水(0.1%三氟乙酸)＝50:50为最佳溶剂.与此同时，供试品溶液稳定性试验表明，9 h内Cu(ATSM)的峰面积基本不变，不会因为溶剂中的三氟醋酸而发生降解.另一方面，三氟醋酸可与Cu(ATSM)形成离子对，能增加Cu(ATSM)的溶解度，改善其在ODS柱上的保留行为，改善峰形，克服峰展宽和拖尾问题.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Determination of Cu(ATSM)in Cu(ATSM)suspension by HPLC

QIU Li-ying1，2，LUO Yao1，PAN Hong-yan1
(1.School of Pharmacy，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041 P.R.C.；2.Regenerative Medicine Research Center，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041 P.R.C.)

Objective To establish a HPLC mehod for the determination of Cu(ATSM)in Cu(ATSM)suspension.Methods This HPLC method was carried out by using ODS column and UV detection at 305 nm with gradient elution consisting of acetonitrile and water(0.1%trifluoroacetic acid).Result The calibration curve was linear(r＝0.9967)within the range of 5.0～100 μg· mLˉ1for Cu(ATSM)，and the limit of detection was 2 ng(S/N＝3).The average recovery was 103.0%with RSD of 1.98%(n＝6).Conclusion This method is simple，sensitive，accurate and specific.It is suitable for the quality control of Cu(ATSM) preparations.

HPLC；copper；Cu-diacetyl-bis(N4-methylsemithiocarbazone)

R284

A

2095-4271(2016)05-0507-04

10.11920/xnmdzk.2016.05.007

2016-07-26

仇丽颖(1980—)，女，汉族，辽宁沈阳人，副教授，博士，研究方向:药物分析.E-mail:qiu7992＠sina.com

国家自然科学基金(81300107)；中国博士后科学基金(2013M542275)