GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A在亲子鉴定中的应用

练勇伶，邱平明，陈玲

（南方医科大学 法医学院，南方医科大学司法鉴定中心，广东 广州510515）

GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A在亲子鉴定中的应用

练勇伶，邱平明，陈玲

（南方医科大学 法医学院，南方医科大学司法鉴定中心，广东 广州510515）

目的 探讨GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A试剂盒在亲子鉴定中的应用价值。方法 对738例亲子鉴定的1 680份样本，采用Goldeneye 25A试剂盒复合扩增23个常染色体STR基因座和1个Y-STR基因座，评估该系统在亲子鉴定中的排除能力和突变率。 结果采用Goldeneye 25A系统，累积非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。738例亲子鉴定案例中排除亲子关系63例，最常见为9～13个基因座排除；等位基因突变事件22例，其中一步突变21例，二步突变1例，20例表现为1个STR基因座突变，1例表现为2个STR基因座突变；D19S253与FGA基因座的突变率最高，均为5.42×10-3，父系突变与母系突变比例为6.33∶1。Y-STR与Amelogenin基因座的分型结果相符。结论Goldeneye 25A系统用于亲子鉴定是高效的。

法医遗传学；STR；亲子鉴定；GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A

GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A试剂盒（简称Goldeneye 25A）是北京基点认知技术有限公司2015年末推出的一个五色荧光STR复合扩增系统。该系统在GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统20试剂盒的基础上，增加了4个常染色体STR基因座（D22S1045、 D1S1656、D10S1248、D2S441）和1个Y染色体STR基因座（DYS391）。本研究对该系统在738例亲子鉴定中的应用情况进行了分析，评估该系统在亲子鉴定应用中的效果。

1 材料与方法

1.1 实验样本

本鉴定中心2016年1月—2016年5月受理的738例亲子鉴定案件，共1680份样本，包括血痕、血液、毛发、羊水、口腔拭子、肌肉等。738例中，三联体331例，父子二联体244例，母子二联体163例，均知情同意。

1.2 仪器

3500xl遗传分析仪（美国AB公司）。

1.3 方法

除血痕、口腔拭子采用直扩法，其余样品均采用Chelex-100法[1]提取DNA。 采用GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统25A试剂盒复合扩增。PCR反应体系为10 μL，其中含去离子水6 μL、5×PCR反应预混液Ⅳ2μL、5×25A引物混合物2μL、模板为1mm2血痕/口腔拭子或1μL DNA提取液。热循环条件为：95℃2min；94℃5s，60℃1min，循环30次；60℃10min，15℃保温，最终扩增产物于4℃保存。GeneMapper IDX软件分析结果。

1.4 数据分析

累积非父排除率（CPE）参照文献[2]进行计算。对每例案件计算累积亲权指数（CPI）[3]。根据亲权鉴定技术规范[4]，3个以上的基因座不符合遗传规律，则排除父权关系的存在；CPI≥10000，则支持亲权关系的存在；有1~2个基因座不符合遗传规律，可以考虑为基因突变；将与子代新等位基因相差最小的亲代基因视为突变基因，该亲代视为突变基因的提供者，以确定突变基因的父/母来源[5]。

2 结果

2.1 Goldeneye 25A在亲子鉴定中的应用

本系统累积非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。

用Goldeneye 25A系统检测738例亲子鉴定案件，331例三联体案例中认定316例，排除15例，407例二联体案例中认定359例，排除48例（表1）；排除基因座最少4个，多为9～15个基因座，排除概率较高的基因座为Penta E、D18S51和FGA（表2）。Goldeneye 25A认定亲子关系的三联体案例，CPI小于10000的占0.949%（3/316），其中2例小于10 000是因为发生突变。Goldeneye 25A认定亲子关系的二联体案例，CPI小于10 000的占1.114%（4/359），均有突变发生。

表1 738例亲子鉴定的排除情况

表2 各基因座排除情况

2.2 STR突变

Goldeneye 25A系统肯定亲子关系的675例案件中共发现等位基因突变事件22例，20例表现为1个STR基因座突变，1例表现为D19S253与FGA这2个STR基因座均突变；21例为一步突变，1例为二步突变、发生在Penta E基因座。各基因座突变率（表3），其中D19S253与FGA突变率最高；父系突变19例，母系突变3例，父系突变与母系突变的比例为6.33∶1，总的突变率小于0.2%。

表3 各基因座突变率

2.3 三等位基因现象

Goldeneye 25A系统否定亲子关系的63例中发现2例罕见的基因变异，其中1例Penta D基因座上孩子基因型为（9，13，14），峰高比约为1∶1∶1（图1），疑父基因型为（8，12）。

图1 Goldeneye 25A系统和PowerPlex21系统在Penta D基因座的分型图谱

2.4 无效等位基因

用Goldeneye 25A系统检测的738例亲子鉴定案件中，1例亲子鉴定经Goldeneye 25A系统检测，父和子在Penta E基因座均表现为纯合子、且峰高和附近杂合子基因座的峰高接近，经PowerPlex21系统检测证实Goldeneye 25A系统在Penta E基因座出现等位基因丢失，父基因型为（14，19），子基因型为（18，19）（图2）。

图2 Goldeneye 25A系统和PowerPlex21系统检测一例案件在Penta E基因座的分型图谱

3 讨论

3.1 亲子鉴定系统的效能分析

Goldeneye 25A系统的累积非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999，高于Goldeneye 20A试剂盒[6]，表明该系统对于亲子鉴定有更高的效力。

Goldeneye 20A系统中DNA变性-复性-延伸循环进行[7]。Goldeneye 25A系统因复性与延伸温度一致，均为60℃，在引物结合模板DNA的同时进行DNA延伸。Goldeneye 20A直接扩增需2 h 50 min；提取后扩增需2h 30min。Goldeneye 25A系统扩增只需50多分钟，所以Goldeneye 25A系统更省检测时间。

3.2 STR基因座的突变和变异分析

Goldeneye 25A系统认定的675例亲子鉴定中，有12个STR基因座检出突变，突变率最高的基因座是D19S253与FGA，本研究观察到1宗案件在D19S253与FGA两个基因座均发生突变。FGA在本中心大群体样本的研究中也显示该基因座是高突变率基因座。足够大数量的群体样本才可获得比较接近的突变率数据。因此突变率数据要参考大群体样本的研究。目前尚无D19S253在大群体样本中的突变率数据，但本研究显示该基因座可能为高突变基因座，这有待后续亲子案件的积累和进一步观察。而

D13S317、TPOX、D7S820、D1S1656、D8S1179、D5S818、CSF1P0、D3S1358、vWA、D2S441、TH01等基因座未观察到突变事件，与本研究案件数量少有关。本研究观察的减数分裂次数男女比例为1.50∶1，父系突变与母系突变比例为6.33∶1，男性精母细胞成熟所需的分裂次数比女性配子成熟的分裂次数多，父系突变率较高，与既往文献报道相似[8]。

2例三等位基因的个体，分别采用不同的试剂盒进行PCR扩增，其结果一致，说明检出的2例个体三带型等位基因不是污染或泳道渗漏造成的假象，也不是PCR扩增引起的非特异性产物[9]。Penta D表现为三带的案例，其D21S11基因座分型结果为29/31、其中等位基因31的峰高约为等位基因29峰高的2倍，追溯案情确认为21三体综合征。CSF1PO为表现为三带的案例，其D5S818基因座表现正常，排除染色体数量异常；因峰高较低的两个等位基因仅相差一个核心重复序列，推测可能是原本为杂合子的两个等位基因在个体发育过程中，其中的一个等位基因发生了一步滑动错配，从而产生新的等位基因[10]。

Goldeneye 25A系统检测时发现1例亲子鉴定在Penta E基因座出现等位基因丢失。DNA图谱显示该基因座的峰高与附近杂合子基因座的峰高接近，且仅该基因座违反遗传规律，初步预测可能是等位基因丢失，加做PowerPlex21系统检测，确认用Goldeneye 25A检测时在Penta E基因座出现等位基因丢失。目前常使用不同的试剂盒检测或测序来确定是否出现等位基因丢失（无效等位基因）[11]。

近年因入户等需求，亲子鉴定案件量剧增，选择高效的检测系统非常必要。与Goldeneye 20A系统相比，Goldeneye 25A系统检测可获得更多基因座的分型结果，系统效能也优于Goldeneye 20A系统。然而，对于该系统影响亲子鉴定结果判定的STR基因座突变、三带型、等位基因丢失等问题仍需注意，必要时需增加其他检测手段复核，以保证鉴定结果的准确性。

[1][美]John M Butler.法医DNA分型专论[M].第3版.侯一平，李成涛，译.北京：科学出版社，2013：83-117.

[2]侯一平.法医物证学[M].北京：人民卫生出版社，2009：21-23.

[3]GA/T 965-2011，法庭科学DNA亲子鉴定技术规范[S].2011.

[4]SF/Z JD0105001-2010，亲权鉴定技术规范[S].2010.

[5]吕德坚，陆惠玲.DNA亲权鉴定[M].广东：暨南大学出版社，2005：99，108-113.

[6]王洁，焦章平，黄艳梅，等.国产试剂盒GoldeneyeTM20A在亲权鉴定中的应用评估[J].中国法医学杂志，2012，27（3）：205-208.

[7]周保成，许天龙，毛华芬，等.19个STR基因座分型在 741例亲子鉴定中的应用[J].中国法医学杂志，2015，30（4）：396-398.

[8]陈玲，刘超，邱平明，等 STRtyper-10G系统9个STR基因座突变分析[J].中国法医学杂志，2014，29（5）：420-423.

[9]陈芳，陈俭，付颖，等.STR基因座中检出三带型等位基因7例[J].法医学杂志，2014，30（3）：215-216.

[10]陈玲，刘超，邱平明，等.常染色体STR基因座三带型的观察与分析[J].中国法医学杂志，2014，29（4）：316-318.

[11]Ling Chen，Yunchun Tai，Pingming Qiu，et al.A Silent Allele in the Locus D5S818 Contained Within the Power-Plex 21 PCR Amplification Kit[J].Legal Medicine，2015，17（6）：509–511.

（本文编辑：李成涛）

Application of GoldeneyeTMDNA ID System 25A Kit in Paternity Testing

LIAN Yong-ling，QIU Ping-ming，CHEN Ling
（Department of Forensic Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To assess the feasability of applying GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit in paternity test cases.Method 23 autosomal STR loci and 1 Y-STR locus of 1680 samples from 738 cases were amplified with Goldeneye 25A kit to validate its exclusion power and mutation rate.Results The cumulated chance of exclusion and the cumulated discriminating power of Goldeneye 25A were greater than 0.999，999，999，999，999，999，999，999，999，999.63 out of 738 cases were excluded，most of which had 9-13 exclusion loci.22 mutation events were observed.Among them，21 mutations were one step and 1 mutation was two steps;20 cases showed single-locus mutation and 1 case showed two-loci mutation.D19S253 and FGA had the highest mutation rate of 5.42×10-3.The ratio of paternal mutation versus maternal mutation was 6.33∶1.The genotype results of Y-STR were consistent with those of Amelogenin.Conclusion Goldeneye 25A is highly effective for paternity testing.

forensic genetics;STR;paternity testing;GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2016.06.004

1671-2072-（2016）06-0018-05

2016-06-30

练勇伶（1994—），女，硕士研究生，主要从事分子遗传学研究。E-mail：416585484@qq.com。

陈玲（1980—），女，副主任法医师，博士，主要从事法医物证学研究。E-mail：lingpzy@163.com。