高效液相色谱法测定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧，戴群芳，汪保林

（1．江西省南昌市洪都中医院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

高效液相色谱法测定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧1，戴群芳2，汪保林2

（1．江西省南昌市洪都中医院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

目的 建立测定三花膏中蒙花苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 以三花膏中野菊花药材中的主要活性成分蒙花苷为对照品，采用Phenomenex Luna C18反相色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)，以甲醇(A)－含10 mmol／L H3PO4的水溶液(B，48∶52)为流动相进行等度洗脱，流速为1．0 mL／min，检测波长为334 nm，柱温为35℃。结果 蒙花苷质量浓度在4．67～46．74 g／L范围内与峰面积线性关系良好（r＝0．999 9，n＝5），加样回收率为99．75%，RSD为1．80%（n＝6）。结论 该方法简便、准确，专属性强，适用于三花膏中蒙花苷的含量测定。

高效液相色谱法；三花膏；蒙花苷；含量测定

三花膏是南昌市洪都中医院自制制剂（批准文号为赣药制字Z20090089），由木芙蓉花、野菊花、金银花3味药组方。全方具有清热解毒、软坚散结之功效，主治痈疽疔疖、乳痈、以及无名肿毒，临床应用疗效显著。野菊花为菊科 Compositae植物野菊 Chrysanthemum indicum L．的干燥头状花序，具有清热解毒、泻火平肝之功效，多用于疔疮痈肿、目赤肿痛、头痛眩晕等症[1]。其含有木犀草苷、绿原酸、蒙花苷、尿嘧啶、槲皮素、丁香脂素、鹅掌楸碱、麦黄酮、β－谷甾醇、α－香树脂醇、β－香树脂醇、羽扇豆醇、金合欢素、香草酸等多种化学成分[2－5]。野菊花为本制剂的主药之一，而蒙花苷为野菊花药材的重要活性成分。文献[6－8]报道蒙花苷的含量测定多采用高效液相色谱(HPLC)法。为了有效控制该医院制剂的质量，参照2015年版《中国药典（一部）》中药材野菊花的HPLC测定方法并结合文献[9]，以蒙花苷为检测指标，建立了测定本品中蒙花苷含量的HPLC法。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Shimadzu LC－20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BS224 S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Mettler Toledo XS105 DualRange型电子天平(Mettler Toledo公司)；UV－2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ－300DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1．2 试药

蒙花苷对照品（批号为111528－200606，中国食品药品检定研究院，含量为98．3%）；三花膏（洪都中医院制剂中心，批号分别为20160420，20160519，20160515）；甲醇为色谱纯（Merck公司）；水为超纯水（Purifier DZG－303A超纯水系统，博科公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex Luna C18反相色谱柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)－含10 mmol／L磷酸的水溶液(B，48∶52)；流速：1 mL／min；柱温：35℃；检测波长：334 nm；进样量：10 μL。理论板数按蒙花苷计应不低于10 000。在此色谱条件下的色谱图见图1。供试品蒙花苷峰保留时间为17．8 min。阴性对照品溶液在与对照品溶液相同保留时间无吸收峰，表明对含量测定无干扰。

2．2 溶液制备

对照品溶液：精密称取蒙花苷对照品适量，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成质量浓度为77.4 μg/mL的溶液，即得对照品贮备液。

图1 高效液相色谱图

供试品溶液：取本品约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取缺野菊花的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得缺野菊花的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

供试品溶液提取方法考察：选择以测定供试品中蒙花苷的含量为指标，对提取溶剂（因素A）和超声时间（因素B）进行正交试验设计。因素水平见表1，结果见表2。按直观分析，影响含量测定结果的因素为A＞B，最佳提取工艺为 A2B3，故拟选择 A2B3，即供试品以70%甲醇超声处理45 min。由于3种超声时间中含量测定结果基本一致，因此在不影响试验准确性的前提下，综合考虑到时间、成本效益，最终选择超声30 min作为提取条件。

表1 正交试验因素水平表

表2 L9（32）正交试验考察结果

线性关系考察：取2.2项下对照品溶液作为1号对照品溶液，分别精密量取0.5，1.0，1.5，3.0，5.0 mL，置10 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得2号、3号、4号、5号、6号对照品溶液。按拟订色谱条件分别取10 μL进样测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=2.215 64×107X+4 918.75，r=0.999 9。结果质量浓度在4.67～46.74 g/L范围内与峰面积线性关系良好。

检测限测定：精密称取蒙花苷对照品适量，将2.2项下制得的对照品溶液用甲醇逐级稀释，取10 μL进样测定，按3倍信噪比计算化合物的检测限。结果检测限为0.54 ng。

精密度试验：取4号对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，测定各化合物的峰面积。结果的 RSD为0.5%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h时进样，测定峰面积。结果的 RSD为1.0%（n=7），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批三花膏样品6份，每份约2.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液并进样测定含量。结果蒙花苷的平均含量为 0.62 mg/g，RSD为0.5%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量（蒙花苷含量为0.62 mg/g）的三花膏样品6份，每份约2.5 g，精密称定，分别置已加标并经氮气吹干的6个锥形瓶中（90 μg/mL的蒙花苷对照品溶液各15 mL），依法制备供试品溶液。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量及回收率。结果见表3。

表3 蒙花苷加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取9批三花膏样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，每份样品测3次，以外标法计算各指标成分含量。结果见表4。

表4 三花膏中蒙花苷含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分选择

绿原酸、木犀草苷等也是野菊花的主要活性成分［2］，但易与三花膏处方中的金银花药材所含活性成分形成干扰，因此本研究中最终选择具有广泛药理活性，化学性质稳定，且能被准确、灵敏测定的蒙花苷作为三花膏含量控制标准。

3.2 测定波长选择

取蒙花苷对照品适量，用水（10 mmol/L磷酸）-甲醇（52∶48）溶液配制成质量浓度为1.0 g/L的对照品溶液，在190～600 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，测得蒙花苷在334 nm波长处有较大吸收。

3.3 流动相筛选

考察了2015年版《中国药典（一部）》野菊花蒙花苷含量测定项下的流动相甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）［1］、乙腈-甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脱［9］及水（10 mmol/L H3PO4）-甲醇（32∶48），结果，后者洗脱效果较理想，故选择后者为流动相。

3.4 提取方法考察

考察了不同浓度的甲醇溶液与不同提取时间对蒙花苷提取效果的影响，结果表明，70%的甲醇超声30 min的效果较理想，提取充分且效果十分稳定；先用石油醚进行提取，继而弃去石油醚提取液，然后再采用不同浓度的甲醇进行超声提取，结果发现，回收率明显低于单一的超声提取方法。故选择70%甲醇超声处理30 min。

3.5 对照品溶液制备

蒙花苷对照品易溶于热的甲醇溶液中，在制备对照品溶液的过程中，需仔细观察，确保其充分溶解，必要时可采用加热的方法促使其溶解，冷却至室温后再定容至刻度。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：314-315.

［2］冯子明，杨桠楠，姜建双，等.野菊花的化学成分［J］.中国中药杂志，2010，35（24）：3 302-3 305.

［3］王锦越，陈 东，梁丽娟，等.野菊花的化学成分研究［J］.中国中药杂志，2010，35（6）：718-721.

［4］毕跃峰，潘成学，王普菊，等.野菊花的化学成分研究［J］.中国药学杂志，2009，44（12）：894-897.

［5］高美华，李 华，张 莉.野菊花化学成分的研究［J］.中药材，2008，31（5）：682-684.

［6］谭晓杰，贾 英，陈晓辉，等.RP-HPLC法测定野菊花中蒙花苷含量［J］.沈阳药科大学学报，2004，21（6）：434-435.

［7］崔兰冲，李小芩，韩 莹，等.HPLC测定野菊花中蒙花苷与木犀草素的含量［J］.中国中药杂志，2007，32（1）：33-35.

［8］郭美兰，敬应春，蔡国琴.RP-HPLC同时测定野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量［J］.中国现代中药，2012，14（4）：10-13.

［9］孙 菲，孙 欣，金 荣.高效液相色谱法测定香菊胶囊中蒙花苷含量［J］.中国药业，2016，25（8）：72-74.

Content Determination of Linarin in Sanhua Ointments by HPLC

Qiu Hui1,Dai Qunfang2,Wang Baolin2
(1．Nanchang Hongdou Hospital of TCM,Nanchang,Jiangxi,China 330000; 2．Nanchang Institute for Food and Drug Control,Nanchang,Jiangxi,China 330038)

Objective To develop an HPLC method for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．Methods Linarin, which was the main active ingredient of Flos Chrysanthemi Indici in Sanhua Ointments,was used as the reference standard．The isolation was performed on a Phenomenex Luna C18reversed phase column(250 mm× 4．6 mm,5 μm)with the mobile phase consisting of methanol－water(containing 10 mmol／L H3PO4)(48∶52),isocratic elution;the flow rate was 1．0 mL／min,the detection wavelength was 334 nm and the column temperature was set at 35℃．Results The linearity of linarin was good in the range of 4．67－46．74 g／L (r＝0．999 9,n＝5),the average recovery rate was 99．75% and RSD was 1．80%（n＝6）．Conclusion This method is simple,accurate, and specific for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．

HPLC;Sanhua Ointments;linarin;content determination

邱慧，硕士研究生，药师，研究方向为药物分析，（电子信箱）412672105@qq.com；汪保林，硕士研究生，研究方向为药物分析，本文通讯作者，（电话）0791-88538260（电子信箱）rlxlei1021@163.com。

2016－04－22；

2016－06－01）

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)19－0061－03