MMP12 mRNA在人肺腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

陈军 续力云 刘超武 竺王玉 陆畅畅 胡晓斐 乐涵波

MMP12 mRNA在人肺腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

陈军 续力云 刘超武 竺王玉 陆畅畅 胡晓斐 乐涵波

目的 检测MMP12 mRNA在人肺腺癌组织中的表达，探讨其与临床病理特征的关系。方法 收集肺腺癌患者肿瘤组织样本39例，每例患者另取癌旁组织作为对照，应用real-time PCR技术，分别以GAPDH、RPLP0、PUM1、HPRT1和TBP为内参基因分析肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平。扩大样本至103例，以PUM1为内参基因分析肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平及MMP12 mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系。 结果 肺腺癌肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平上调者所占比例较表达水平无改变或表达水平下调者增高，且以PUM1为内参基因检测肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），且MMP12 mRNA在男性患者（男性vs女性，2.07±3.25 vs 0.53±2.90，P＜0.05）、病理亚型为实性/微乳头状生长为主浸润性腺癌（实性/微乳头状生长为主vs附壁样/乳头状/腺泡状生长为主，3.30±2.95 vs 0.75±3.20，P＜0.05）中表达水平上调。结论 MMP12 mRNA在肺腺癌肿瘤组织中表达水平上调，可能参与肺腺癌发生、发展，且性别可能作为肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达水平上调的危险因素。

MMP12 mRNA 肺腺癌 病理亚型 性别

肺癌是全球范围内主要的癌症死亡原因，而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%左右[1]。近年来，肺腺癌发病率越来越高，已取代鳞癌成为肺癌最常见的病理类型[2]。2011年国际肺癌研究协会/美国胸科协会/欧洲呼吸协会对肺腺癌不同病理亚型进行了分类[2]，为肺腺癌的诊断、治疗及预后提供了依据。虽然肺腺癌在诊断及治疗方面不断完善，但其总体预后仍不佳[3]。目前已有大量研究提出了分子标志物在肺腺癌的诊断、治疗及预后评价中的价值[3-5]。然而，肺癌是一种伴有多个主要信号通路改变的具有高度异质性的复合疾病[6]，因此仍需要探索新的分子标志物来预测其预后及提供新的治疗靶点。

Matrix metallopeptidase 12（MMP12）是锌依赖型肽链内切酶家族中的一种基质金属蛋白酶，对NSCLC的局部复发和远处转移具有较好的预测价值[7]。本实验通过real-time PCR技术检测不同病理亚型肺腺癌患者肿瘤组织及相应癌旁组织MMP12 mRNA的表达，探讨其与肺腺癌临床病理特征的关系，为进一步评价MMP12在肺腺癌的诊断、治疗及预后中的价值提供依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2014年1月至2015年6月本院收治并经手术病理证实的肺腺癌患者肿瘤组织样本共103例，其中男36例，女67例。所有患者术前均未行化疗、放疗或其他肿瘤相关治疗，每例患者另取相应癌旁组织作为对照。所取标本均经过患者及医院伦理委员会同意。

1.2 试剂和仪器 RNA提取试剂盒（mirVana RNA PARIS Kit，美国Life公司）、RNA逆转录试剂盒（美国Promega公司）、real-time PCR试剂盒（日本Takara公司）、7500 real-time PCR仪（美国ABI公司）、低温离心机（美国PE公司）。

1.3 引物的设计和合成 所有引物序列均引用于Pubmed、Nucletide Tools，其序列均来自各基因转录本的编码序列，且所有引物设计条件均满足以下条件：引物长度为17～25bp，GC含量保持在45%～55%，熔链温度为60℃左右，A、C、G、T碱基分布均匀。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。MMP12及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、核糖体磷酸化蛋白大亚基P0（Ribosomal Protein Lateral Stalk Subunit P0，RPLP0）、短小杆菌RNA结合蛋白家族成员1（Pumilio RNA Binding Family Member 1,PUM1）、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1，HPRT1）、TATA框结合蛋白（TATA-Box Binding Protein，TBP）等5个内参基因引物序列见表1。

表1 MMP12及内参基因引物序列

1.4 总RNA提取及cDNA合成 取适量肺腺癌患者肿瘤组织及相应癌旁组织，在液氮中研磨成粉末，用TRIzol法提取组织总RNA，并溶于DEPC水中保存，经RNA逆转录试剂盒合成cDNA。

1.5 应用real-time PCR技术检测MMP12 mRNA表达 先采用real-time PCR技术检测2014年1至6月39例肺腺癌患者肿瘤组织及相应癌旁组织的MMP12 mRNA表达，扩增反应条件：94℃预变性15s，95℃30s，60℃15s，扩增40个循环，最后72℃延伸30s。分别以GAPDH、RPLP0、PUM1、HPRT1、TBP等5个基因为内参基因，计算各样本组织ΔCt值（MMP12 Ct值-各内参基因Ct值），采用2-ΔCt法，计算MMP12 mRNA相对表达量（relative quantity of expression，RQ）。通过公式FC= RQ肿瘤/RQ癌旁得到肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达差异倍数（fold changes，FC），转换为对数值log2FC以分析肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平。对于FC≥2，即log2FC≥1，认为MMP12 mRNA在肿瘤组织中表达水平上调；1/2＜FC＜2，即-1＜log2FC＜1，认为MMP12 mRNA在肿瘤组织中表达水平无变化；FC≤1/2，即log2FC≤-1，认为MMP12 mRNA在肿瘤组织中表达水平下调。计算log2FC值分析39例肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平。以后进一步扩大样本量，对2014年6月至2015年6月的64例患者以PUM1为内参基因，计算各样本组织RQ值，将各RQ值转换为对数值log2RQ对各样本组织MMP12 mRNA表达水平进行分析。比较103例肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平log2RQ，并计算log2FC值分析肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。在分析肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平log2RQ时，以中位数表示，两者比较采用秩和检验；在分析肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平log2FC与临床病理特征关系时，以表示，两者比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同内参基因MMP12 mRNA表达水平的变化 不同内参基因分析结果显示，肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达水平上调者所占比例较表达水平无改变或表达水平下调者增高，见表2。

表2 不同内参基因MMP12mRNA表达水平的变化[例（%）]

2.2 以PUM1为内参基因肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平的比较 以PUM1为内参基因，计算103例肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织log2RQ值。肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达中位数为0.085，癌旁组织MMP12 mRNA表达中位数为-0.965，肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），见图1。

图1 103例肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达水平的比较

103例肺腺癌肿瘤组织中，MMP12 mRNA表达水平上调者50例（48.6%），表达水平无改变者30例（29.1%），表达水平下调者23例（22.3%），见图2。结合图1-2结果表明，肺腺癌肿瘤组织MMP12 mRNA表达上调。

2.3 MMP12 mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系 肺腺癌肿瘤组织相对于癌旁组织MMP12 mRNA表达水平与患者年龄、吸烟史、肿块大小、淋巴结转移、胸膜侵犯、临床分期差异均无统计学意义（均P＞0.05），与性别和浸润性肺腺癌不同病理亚型之间差异均有统计学意义（均P＜0.05），在男性患者、病理类型为实性/微乳头状生长为主的浸润性肺腺癌中表达水平上调，见表3。

图2 103例肺腺癌肿瘤组织MMP12mRNA表达水平分布图

表3 MMP12mRNA表达水平与肺腺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

目前，肺癌是人类发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌是肺癌最常见的病理类型。由于肺癌的高度侵袭性及异质性，多数肺癌患者在确诊时已经发生淋巴结、血行或远处转移，是其预后较差的主要原因[8]。MMP12 mRNA表达产生的基质金属蛋白酶是一类具有降解细胞外基质的蛋白酶，通过降解细胞外胶原蛋白及基底膜成分使恶性肿瘤细胞向相邻周围组织浸润、迁移及转移[9]。本研究通过real-time PCR技术检测肺腺癌肿瘤组织及相应癌旁组织MMP12 mRNA的表达情况，探讨其与肺腺癌临床病理特征的关系，结果发现MMP12 mRNA在肺腺癌肿瘤组织中表达水平上调，并在男性患者和实性/微乳头状生长为主浸润性腺癌患者中表达水平上调。

Vandesompele等[10]研究证实，同时使用多个内参基因对荧光定量PCR实验结果进行标准化校正，可有效减少实验误差，故本研究中分别以GAPDH、PUM1、RPLP0、HPRT1、TBP为内参基因，检测肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达情况。根据实验结果筛选出相对稳定的内参基因PUM1，与Soes等[11]研究结果一致，并以PUM1为内参基因，扩大样本量，再次检测肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA的表达情况，结果均显示MMP12 mRNA在肺腺癌肿瘤组织中表达水平上调，与Hofmann等[7]的报道结果一致。本研究运用多个内参基因对real-time PCR实验结果进行标准化校正，而在之前对MMP12 mRNA的研究中未见有报道。

MMP12最初被认为是由炎性巨噬细胞所分泌的一种促进弹性纤维溶解的金属蛋白酶[12]。该酶具有广泛的底物特异性，包括细胞外基质蛋白如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白等，它也能通过水解血纤维蛋白溶酶原生成血管抑素。目前，MMP12 mRNA已被证实在肺癌、肝癌、大肠癌、外阴癌和胰腺癌等诸多癌症肿瘤组织中有表达[7]。Hofmann等[7]报道MMP12 mRNA的表达能较好地预测NSCLC肿瘤早期复发和转移的风险。Lv等[13]通过体外细胞培养研究也证实，敲除MMP12基因可以有效地抑制肺腺癌细胞的生长和浸润。因此，MMP12 mRNA表达水平上调提示肺腺癌患者预后不佳。然而，MMP12 mRNA表达在不同病理亚型的肺腺癌之间是否存在差异尚未见有报道。Yoshizawa等[14]提出，肺腺癌新分类是依据预后的差异进行的组织学分类，其研究结果显示，实性/微乳头状生长为主的浸润性腺癌其5年无病生存率较附壁样/乳头状/腺泡状生长为主的浸润性腺癌低，即预后较差。本研究通过real-time PCR技术检测不同病理亚型的肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织MMP12 mRNA表达，结果显示MMP12 mRNA表达与浸润性肺腺癌的不同病理亚型密切相关，在实性/微乳头状生长为主的浸润性腺癌中表达水平上调，从而也提示，MMP12 mRNA表达水平上调的肺腺癌预后较差，与现有研究结果相一致。此外，本研究通过对肺腺癌患者临床特征比较，发现MMP12 mRNA表达水平在性别之间差异有统计学意义，在男性肺腺癌患者中表达水平上调，提示性别可能作为肺腺癌患者肿瘤组织中MMP12 mRNA表达水平上调的危险因素，且可能提示肺腺癌男性患者预后较女性患者差。

目前，由于肺腺癌在临床表现、影像学表现、生物学表现、病理分型等方面存在诸多差异，导致诊断及治疗方面效果不尽人意，总体预后仍然欠佳。因此，本研究通过检测MMP12 mRNA在浸润性肺腺癌不同病理亚型之间的表达差异，揭示MMP12可能参与肺腺癌的发生、发展，因此检测MMP12 mRNA对于肺腺癌的早期诊断与鉴别诊断，指导治疗及预后评估具有重要意义，但MMP12 mRNA在肺腺癌发生、发展过程中的作用机制，以及MMP12 mRNA与性别可能存在的相互关系及性别与肺腺癌发生、发展过程可能存在的联系仍需进一步研究。

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Expression of MMP12 in human lung adenocarcinoma and its clinopathological significance

CHEN Jun,XU Liyun,LIU Chaowu,etal.Department of Cardiothoracic Surgery,Affiliated Zhoushan Hospital of Wenzhou Medical University,Zhoushan 316021，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of MMP12 mRNA in human lung adenocarcinoma and its clinicopathological significance.Methods The expression of MMP12 mRNA was detected with real-time quantitative PCR using GAPDH,RPLP0,PUM1,HPRT1,TBP as reference genes in 39 specimens of lung adenocarcinoma and corresponding pericancerous tissues.The expression of MMP12 mRNA was also detected in 103 samples of lung adenocarcinoma tissue (including above 39 cases)with PUM1 as reference gene.The association between expression of MMP12 mRNA and clinical and pathological characteristics of lung adenocarcinoma was analyzed.Results More adenocarcinoma samples had MMP12 mRNA up-regulated than samples with not-changed or down-regulated MMP12 mRNA,and the expression of MMP12 mRNA was significantly higher in tumor tissues than that in pericancerous tissues(P＜0.05).The rate of MMP12 mRNA expression was significantly higher in male patients than that in females(2.07±3.25 vs 0.53±2.90,P＜0.05),and in invasive solid or micropapillary predominant tumors was higher than that in lepidic,papillary or acinar predominant tumors(3.30±2.95 vs 0.75±3.20,P＜0.05). Conclusion The expression of MMP12 mRNA is up-regulated in lung adenocarcinoma,particularly in male patients,indicating that MMP12 may be associated with occurrence and development of lung cancer.

MMP12 mRNA Lung adenocarcinoma Histopathologicalsubtypes Gender

2016-07-28）

（本文编辑：陈丽）

浙江省科技厅分析测试科技计划项目（2015C37024）；浙江省医药卫生科技计划重点资助项目（2015ZDA032）；浙江省医药卫生科技计划一般项目（2015KYB411）；舟山市公益类科技项目（2014C31065)；浙江省医药卫生平台计划（2016R CB020）；浙江省科技厅省级公益技术应用研究计划项目（2016C37008）

316021 温州医科大学附属舟山医院胸心外科（陈军、刘超武、乐涵波），细胞分子生物实验室（续力云、竺王玉、陆畅畅、胡晓斐）

乐涵波，E-mail：zslehanbo@163.com