高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定小儿清热宁颗粒中胆酸的含量

崔梦丽 刘雅敏 胡春月 崔 浩 陈 庆 苏 梦 朱宝玉

(1 河南中医学院，郑州，450046； 2 辅仁药业集团有限公司，郑州，450008)



高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定小儿清热宁颗粒中胆酸的含量

崔梦丽1刘雅敏1胡春月1崔 浩2陈 庆1苏 梦1朱宝玉1

(1 河南中医学院，郑州，450046； 2 辅仁药业集团有限公司，郑州，450008)

目的：建立小儿清热宁颗粒中胆酸的含量测定方法；方法：样品制备采用甲醇超声30 min提取，色谱条件为色谱柱Venusil XBP C18(L)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇-1%冰醋酸溶液(75∶25，v/v)，流速1.0 mL/min，柱温为25 ℃；检测器漂移管温度控制为40 ℃，载气气体流速为2.0 L/min，增益为4。结果：胆酸的工作曲线为lg A=1.582 lg C+2.972 9(r=0.999 4)，进样量在0.502～2.51 μg范围内呈良好的线性关系，回收率的RSD为1.969 6%。阴性对照无干扰。结论：所建立的含量测定方法专属性强，可用于小儿清热宁颗粒的质量控制。

高效液相色谱-蒸发光散射法；小儿清热宁颗粒；胆酸

小儿清热宁颗粒是治疗小儿病毒性感冒的常用中成药，具有解热镇痛、提高免疫力等作用，收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十二册。由黄芩、板蓝根、金银花、柴胡、羚羊角粉、水牛角浓缩粉、人工牛黄、冰片8味药组成[1]。目前该药尚无人工牛黄的质量控制标准，仅见于对其中胆红素进行含量测定的研究报道[2]，但是胆红素不是解热镇痛抗病毒的有效成分[3-4]。人工牛黄的主要成分是胆酸(含量不小于13%)，具有解热镇痛抗炎的作用，是小儿清热宁颗粒的有效成分[5-7]，因此，应对胆酸含量建立质控标准。胆酸在小儿清热宁颗粒处方中含量极低，约占0.06%，而且胆酸结构中不含生色团，紫外吸收波长在192 nm左右，用HPLC紫外检测进行定量分析时，会出现流动相干扰性大、检测灵敏度低等缺陷。蒸发光检测器其响应值不依赖于样品的光学特性，而取决于被测物质颗粒的数量和大小，对无紫外吸收或紫外末端吸收的物质具有较高的检测灵敏度[8]。因此，本实验研究建立高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定方中胆酸含量的方法，为小儿清热宁颗粒中人工牛黄的质量控制提供方法和依据。

1 材料

1.1 仪器 METTLER AE240十万分之一天平(德国梅特勒公司)；高效液相色谱系统：Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Alltech 3300蒸发光散射检测器(ELSD)；BSA 124S万分之一天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；UPD-II-107型优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司)；DHG-9123A型电热鼓风恒温干燥箱(郑州生元仪器有限公司)；KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品 胆酸对照品(购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100078-200414)；小儿清热宁颗粒(河南辅仁堂制药有限公司，批号：201406041、201406012、201405081、201406021、201403122、201404082)；无胆酸的阴性样品(自制)。

1.3 试剂 甲醇(DIKMA TECHNOLOGIES IN，批号：50102)，冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20140122)，均为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的胆酸对照品25.10 mg，置25 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液；精密吸取储备液1 mL置10 mL棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，对照品溶液浓度为0.100 4 mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备[9]取小儿清热宁颗粒2袋，研细，精密称取4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称重，30 ℃超声(功率150 W，40 kHz)提取30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液于蒸发皿中，70 ℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，摇匀，制成供试品溶液。

2.1.3 阴性对照品溶液的制备 按小儿清热宁颗粒制备工艺，制备不含人工牛黄的阴性颗粒。精密称取阴性样品，照“2.1.2”项下方法制成阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件与系统适应性 ELSD参数：漂移管温度：40 ℃，载气气流流速：2.0 L/min，增益=4。色谱柱：Venusil XBP18(L)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液(75：25，v/v)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：20 μL。理论塔板数按照胆酸计算≥5 000，分离度>1.5。

2.3 专属性 分别取“2.1.1”项下制备的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪，照“2.2”项下色谱条件操作进样，记录色谱图。结果见图1，显示胆酸峰分离度良好，阴性样品无干扰。

图1 高效液相色谱-蒸发光散射色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取胆酸对照品溶液5，8，10，12，15，20，25 μL，依次注入液相色谱仪，照“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积。以胆酸进样量的对数值(lgC)与峰面积的对数值(lgA)进行线性回归，得胆酸的工作曲线：lg A=1.582 lg C+2.972 9(r=0.999 4)。

2.4.2 精密度 精密“2.1.1”项下吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，照“2.2”项下色谱条件进行测定，计算峰面积，RSD值为0.87%。表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性 分别精密吸取胆酸对照品溶液10 μL、供试品溶液20 μL，室温放置0，2，5，8，12，24 h，照“2.2”项下色谱条件进样测定，对照品溶液和供试品溶液峰面积的RSD值分别为2.06%，1.69%。表明对照品溶液和供试品溶液在室温情况24 h内，溶液稳定性良好。

2.4.4 重复性 精密称取同一批号(201406021)的小儿清热宁颗粒6份，按照“2.1.2”项下的方法平行制备供试品溶液，照“2.2”项下色谱条件进样测定，计算样品中胆酸含量。小儿清热宁颗粒中胆酸的平均含量为0.046 02 mg/g，RSD值为0.88%。表明本方法重复性良好。

2.4.5 回收率 精密称取同一批已知含量的样品(批号：201406021)9份，每份4 g，分成3组。分别精密加入胆酸对照品溶液1、1.5、2.5 mL，依法制备供试品溶液并测定胆酸含量。计算加样回收率。结果见表1。检测结果表明，回收率的RSD为1.97%，本方法准确度高。

表1 胆酸加样回收率试验

2.5 样品含量测定 取6个批次的小儿清热宁颗粒，按照“2.1.2”项下方法制备样品，并按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算胆酸含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

1)关于从牛黄或复方中提取胆酸制备供试品的方法，文献报道主要有乙酸乙酯超声[10]，氯仿超声[5]，石油醚超声[4]。本实验采用甲醇超声提取与之对照，发现甲醇超声提取率较高。推测原因应当是胆酸在人工牛黄中以胆酸盐形式存在的比例高，甲醇极性大于上述溶剂，因此甲醇的提取率高。实验还比较了超声提取和加热回流2种提取方式，结果证明两者的提取率无明显差异，因此选择操作简便的超声提取。

2)胆酸分子结构状态受pH的影响。当pH值为4～6时，游离胆酸以离子型和非离子型2种形式存在[11]，蒸发光检测器对分子型胆酸有很好的检测灵敏度。有研究者对其研究的复方采用甲醇提取，过中性氧化铝柱[4]、水液稀盐酸调节pH至酸性-乙酸乙酯萃取[12-13]胆酸等分子态胆酸的富集纯化方法，再用酸性流动相分离检测。本实验采用甲醇超声提取液直接进样，以甲醇-0.1%冰醋酸的酸性系统为流动相，抑制胆酸电离，其检测效果与上述提取纯化供试品无明显差异。本实验采用的这种测定方法可以简化样品制备过程，便于在生产实际中应用。

3)ELSD对检测性能的主要影响在于载气气流流速、漂移管温度和增益[14-15]。载气气流流速与基线的稳定性有关，漂移管温度直接决定检测中流动相的挥发性，增益影响检测器对散射光的灵敏程度。实验过程中，分别考察了不同载气气流流速(1.5、2、2.5 L/min)，不同漂移管温度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)，不同增益(1、2、4、8、16)对响应值及信噪比的影响。综合分析色谱图发现：增益=4，载气气流流速=2.0 L/min，漂移管温度=40 ℃条件时，噪声最小，进样分析的峰形良好，基线稳定。

本实验建立的高效液相-蒸发光法测定小儿清热宁颗粒中胆酸含量方法，具有操作方法简捷，分析条件易于精确控制，待测成分易于分离等优点，且通过上述方法学考察，证明此方法具有较好的重现性和较高的精密度。

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(2015-08-05收稿 责任编辑：洪志强)

Determination of Cholic Acid in Xiaoer Qingrening Granule by HPLC-ELSD

Cui Mengli1, Liu Yamin1, Hu Chunyue1, Cui Hao2, Chen Qing1,Su Meng1, Zhu Baoyu1

(1HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China;2FurenPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.,Zhengzhou450000,China)

Objective:To establish an HPLC-ELSD method for determination of cholic acid in Xiaoer Qingrening Granule. Methods:Samples were prepared by ultrasonic extraction of methanol for 30 min. Venusil XBP C18(L) (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column was used with methanol-0.1% phosphoric acid solution (75∶25, v/v) with the mobile phase at 1.0 mL/min. The temperature of column was set at 25 ℃ and drift tube was 40 ℃. The flow rate of gas was maintained at 2.0 L/min. Results:The linearity was obtainedfrom 0.502～2.51 μg (r=0.999 4). The average recovery was 100.532 1% withRSD=1.969 6%. Conclusion:The method is specific, and can be used for quality control of Xiaoer Qingrening Granule.

HPLC-ELSD; Xiaoer Qingrening Granule; Cholic acid

国家科技重大专项(编号：2013ZX09201023)

崔梦丽(1990.03—)，女，河南郑州人，硕士研究生，研究方向：中药制剂技术与质量控制研究

刘雅敏(1960.06—)，教授，研究方向：主要从事中药制剂技术与质量控制研究，E-mail：l_yamin@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.041