基于ITS序列的伞菌类药用食用真菌的DNA条形码鉴定研究

刘 悦 汤 欢 李西文 陈增华 雷志勇 向 丽

(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科学研究院，北京，100005)



基于ITS序列的伞菌类药用食用真菌的DNA条形码鉴定研究

刘 悦1汤 欢1李西文1陈增华2雷志勇2向 丽

(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100700； 2 北京千菌方菌物科学研究院，北京，100005)

目的：伞菌类真菌物种繁多、生物多样性丰富，包括多种重要的药用、食用真菌以及有毒真菌。因此，对该类群的快速、准确鉴定，对于新的药用食用真菌资源的发现，以及对真菌毒素危害的防治都具有重要意义。方法：本研究以伞菌类13个科23个属50个物种，共计84份样本的真菌为研究对象，采用真菌通用引物ITS5和ITS4，对其核糖体DNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)进行PCR扩增和测序。通过比较不同真菌的序列长度、碱基构成，同时利用BLAST比对法和建树法对其进行鉴定。结果：伞菌类真菌的序列长度在463～751 bp之间，平均GC含量在37.1%～59.4%之间。通过与GenBank中序列的比对分析以及系统进化邻接(Neighbor-joining，NJ)树结果，可以在种级水平上鉴定各个真菌物种。结论：基于ITS序列的DNA条形码可以快速、准确鉴定伞菌类真菌，具有重要的应用价值。

药用真菌；食用真菌；伞菌类；DNA条形码；ITS

伞菌目(Agaricales)又称蘑菇目，为担子菌一个大目，特点是具有菌盖和菌柄，呈蘑菇状。伞菌类真菌多成世界性分布，从北极至热带的多林地带都有发现。目前，伞菌目已有33个科，413个属，13 000余个物种已被识别，我国已报道的物种约占全世界已知物种的1/5[1]。在伞菌类真菌中，包括有味道鲜美而具有较高营养价值的食用菌，如侧耳科侧耳属的刺芹侧耳、白灵侧耳等；有重要的药食两用真菌，如侧耳科侧耳属的金顶侧耳和光柄菇科小包脚菇属的草菇等；此外，伞菌类真菌还包括较多含有毒性的真菌，如球盖菇科垂幕菇属的簇生黄韧伞、白蘑科杯伞属的白杯伞以及鹅膏菌科鹅膏属的致命鹅膏等[2-5]。由此可见，伞菌类真菌具有丰富的物种多样性，实现对该类群的快速、准确鉴定，对于新的药用食用真菌资源的发现，以及对有毒真菌的预防等都具有重要意义。

DNA条形码从基因角度解释了药用动植物物种鉴定的问题[6]。近年来，随着该方法的深入研究与普及，该方法已经成为传统鉴定方法的有效补充，并成为药用动物、植物鉴定的重要方法[6，8-12]。如，DNA条形码技术对名贵真菌类药材冬虫夏草、灵芝及其混伪品等[13-17]。传统的伞菌类真菌分类与鉴定多是根据子实体以及孢子等的形态特征，但有时会受到环境影响，真菌的形态差异会有较大差异，给鉴定带来一定困难[18]。此外，一些真菌的培养物只有菌丝体，而不产生孢子，更加大了鉴定的难度[19]。近年来，研究者们采用DNA条形码技术对真菌的分类与鉴定展开了大量的研究[20-22]。在对菌物DNA条形码标准序列筛选的过程中发现，ITS序列适宜的真菌类群范围较广，引物通用性强，PCR扩增、测序以及鉴定成功率都相对较高。此外，在GenBank等数据库中存有大量的真菌ITS序列，更便于真菌序列的比对研究[19]。在第四届国际生命条形码大会上正式推荐了ITS作为真菌的首选DNA条形码[4，19]。本研究应用ITS序列，以伞菌类13个科23个属50个物种，共计84份样本为研究对象，探索ITS序列对伞菌类真菌鉴定的可行性与可靠性。

1 材料和方法

1.1 实验材料 本研究以本研究以伞菌类13个科23个属50个物种，共计84份样本的真菌为研究对象，进行DNA条形码鉴定研究，实验材料经中国科学院微生物研究所卯晓岚研究员鉴定。凭证标本存放于中国中医科学院中药研究所，详细研究材料见表1。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序 用75%乙醇擦拭真菌后，刮去其表面，取其内部组织约30 mg，用高通量组织研磨仪(宁波新芝，中国)研磨200 s(50 Hz)后，利用真菌基因组DNA提取试剂盒(BioTeke公司，中国)提取总DNA。扩增ITS序列正向引物ITS5F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，反向引物ITS4R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR反应体积25 μL，PCR反应体系为25 μL，包括2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板2～3 μL，其余体积以ddH2O补充。序列扩增及测序均依照中药材DNA条形码分子鉴定标准操作流程(DNA barcoding SOP)进行[23-24]。

1.3 数据处理 测序峰图使用CodonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.，USA)进行质量校对与拼接，去除低质量序列及引物区，进行多序列比对并人工校验。将所有获得的ITS序列用MEGA6.0(Center for Evolutionary Medicine and Informatics，USA)(MUSCLE option)进行序列分析比对。最后采用相似性搜索法(BLAST)，以及构建系统进化邻接树(neighbor-joining method)的方法来考察ITS序列鉴定的成功率。

2 结果

2.1 伞菌类真菌ITS序列特征 实验结果表明，ITS序列在伞菌类真菌样本中显示出较好的通用性，PCR扩增效率和测序成功率均为100%。比较84条ITS序列后发现：各个物种的序列长度各有差异(表1)，其中蜡伞科(Hygrophoraceae)的Hygrophorusquercetorum序列长度最短，为463 bp；膨瑚菌科(Physalacriaceae)科的假蜜环菌Armillariatabescens序列长度最长，为751 bp。各物种的平均GC含量在37.1%～59.4%之间，蜡伞科(Hygrophoraceae)科的Hygrophorusquercetorum最低，而光柄菇科(Pluteaceae)科的草菇Volvariellavolvacea平均GC含量最高。

2.2 相似性搜索结果 本文采用比对法(BLAST)对84条实验序列进行鉴定，结果表明在属水平上鉴定成功率为100%；在物种水平上，鉴定成功率为89%，有9个真菌样本在GenBank中未能搜索到相同序列，仅能比对到属，这些真菌包括芳香杯伞Clitocybefragrans、大白桩菇Leucopaxillusgiganteus、侧耳Pleurotusostreatus、Hypholomadispersum、Hygrophorusquercetorum、灰紫鳞丝盖伞Inocybegriseolilacina、Inocybejacobi以及Lycoperdoncaudatum。

2.3 系统进化树鉴定结果 从基于ITS序列的系统进化NJ树看出(图1)，ITS序列可以鉴定实验研究所用的伞菌类的13个科23个属50个物种。其中，在BLAST比对法中仅能比对到属水平的9个物种在NJ树中也都能够与其他同属物种分开，并各自为一支。此外，具有较高营养价值的真菌，如侧耳科(Pleurotaceae)侧耳属的刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、白灵侧耳(Pleurotusnebrodensis)等；重要的药食两用真菌，如侧耳科侧耳属的金顶侧耳(Pleurotuscitrinopileatus)和光柄菇科(Pluteaceae)小包脚菇属的草菇(Volvariellavolvacea)等，以及有毒的鹅膏菌科(Amanitaceae)科的鹅膏菌属(Amanita)真菌、球盖菇科(Strophariaceae)科垂幕菇属(Hypholoma)真菌以及丝盖伞科(Inocybaceae)科的丝盖伞属(Inocybe)真菌等均能够与其他的真菌区分开。由此可见，采用基于ITS序列的系统进化NJ树可以鉴定实验研究中的50种伞菌类真菌。

图1 基于IT序列构建的伞菌类50个物种的系统进化邻接树

3 讨论

据统计，全世界的真菌物种多达150万余种，其数量和种类在生物界中仅次于昆虫而位列第二[25]。真菌丰富的生物多样性、重要的生态作用以及巨大的药用、食用价值使其在生物中占有举足轻重的地位。传统的真菌鉴定方法主要以其形态特征、生理学特征以及生态学特征等作为判定依据。但是真菌种类繁多，个体多态性显著或物种之间形态十分相似，易受培养条件等外界因素的影响，为真菌的鉴定带来了一定的困难。与传统分类鉴定方法不同，DNA条形码克服传统形态学表型相似或差异大、鉴定人员需具备较为扎实的专业知识等困难，从基因角度背景阐明物种来源，目前已成为物种快速鉴定的重要途径。

表1 伞菌类实验材料信息

由于真菌丰富的生物多样性，研究者们对真菌DNA条形码标准序列的选择也做了大量的研究工作。其中COI和ITS序列被证明是在真菌鉴定工作中成功率较高的两条序列[26-27]。研究表明，COI基因是内含子含量较多的序列，有时其片段长度超过20 bp，会影响PCR扩增而不利于获取DNA序列[28]。而ITS序列引物通用性强，扩增成功率较高，更便于高通量测序与分析，因此更适合作为真菌鉴定的首选条形码[19]。

本研究采用ITS序列对伞菌类13个科23个属50种真菌进行鉴定研究。通过比较各个物种ITS序列发现，不同物种在序列长度以及碱基构成方面的差异。BLAST比对结果表明，除个别物种外，DNA条形码鉴定结果与前期形态鉴定结果基本一致。结合NJ树结果，则能将这50种伞菌类真菌物种鉴定到种级单元，并可确定同物异名的真菌。此外，侧耳属等重要药用、食用真菌以及鹅膏属、杯伞属等有毒真菌均可与其他真菌物种明显区分。因此，ITS序列在伞菌类真菌中鉴定的可行性，对未来伞菌类真菌的鉴定、有毒真菌与无毒真菌鉴定区分，以及药用食用真菌的生产栽培以及开发利用都具有重要的意义。

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(2016-04-12收稿 责任编辑：洪志强)

Identification of Medicinal and Edible Fungi(Agaricales)Through Internal Transcribed SpacerBarcode

Liu Yue1，Tang Huan1，Li Xiwen1，Chen Zenghua2，Lei Zhiyong2，Xiang Li1

(1InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700,China; 2BeijingQianjunfangAcademyofFungalScience，Beijing100005,China)

Objective:With abundant fungi species and rich biodiversity，Agaricales comprises a variety ofmedicinal，edible and poisonous fungi.To identify these fungi have important significance for the discovery of new medicinal edible fungi resources，and the prevention of mycotoxin hazard.Methods:In this study，50 species belong to 23 genus of 13 families in Agaricales were identified by DNA barcode.The internal transcribed spacer(ITS)were amplified and sequenced.Sequence lengths，base compositions were compared，and sequences results were analyzed using BLAST.A phylogenetic neighbor-joining(NJ)tree was also constructed for the identification of above-mentioned species.Results:The results indicated that the ITS sequence lengths of 50 fungi species ranged from 463 to 751 bp and the GC content intermediate between 37.1% and 59.4%.Finally，all 50 species were clearly identified by BLAST and NJ tree.It is concluded that the ITS region can rapidly and accurately identify Agaricales species.Conclusion:The proposed DNA barcode has great application value in fungi species identification.

Medicinal Fungi；Edible Fungi；Agaricales；DNA barcode；ITS

中央科研院所公益项目(编号：ZXKT15029；ZZ2014029)；重大新药创制国家科技重大专项(编号：2014ZX09304307001-014；2014ZX09301308-007)

向丽，助理研究员，主要研究方向：中药资源栽培与药用真菌分子鉴定，Tel：(010)84084107，E-mail：lxiang@icmm.ac.cn

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.009