冻融辅助超声波法提取金针菇菇根蛋白的工艺研究

朱广成，魏书信，路风银

（河南省农业科学院农副产品加工研究所，河南郑州 450002）

冻融辅助超声波法提取金针菇菇根蛋白的工艺研究

朱广成，魏书信，路风银

（河南省农业科学院农副产品加工研究所，河南郑州 450002）

为了实现金针菇采后完全利用、提升金针菇采后价值，以金针菇菇根为试材，采用冻融辅助超声波法提取金针菇菇根中的蛋白质。在单因素试验和组合试验基础上，选取冻融次数、料液比、超声功率、超声时间为提取工艺因素，以蛋白提取得率为指标，通过正交试验优化得到的最佳提取工艺参数为冻融次数3次，料液比1∶8，超声功率700 W，超声时间11 min，在此最佳工艺条件下的蛋白提取得率为1.31%。冻融辅助超声波提取为纯物理提取方法，整个提取中无任何化学添加，提取工艺安全环保，具有良好的实际推广价值。

金针菇根；冻融；超声；蛋白；提取

金针菇是我国少数几个实现大范围工业化栽培、能全年提供鲜菇供应的食用菌品种之一，其富含蛋白质、维生素、铁、钙、镁等营养成分，还含有核糖体失活蛋白、金针菇毒素、免疫调节蛋白、金针菇多糖等活性成分[1-2]，常食具有提高免疫、抗过敏等食疗功效[3]，故深受消费者的喜爱。床栽金针菇在采收后商品化出售之前，必须做切根处理，因此每年产生大量的金针菇根。目前，金针菇菇根主要作为饲料或被直接废弃，产生资源严重浪费的同时还造成环境污染，而关于金针菇菇根的研究极少。蛋白质是金针菇菇根中的主要成分之一，研究表明，鲜金针菇菇根中的总蛋白质含量达4.07%[4]。以对金针菇菇根中的蛋白质资源进行开发利用，不仅可提高金针菇的采后价值，还可以减少资源的浪费和对环境的污染。

蛋白质的提取工艺目前应用最多的主要有热水浸提法[5]、碱法[6]、酶法[7]、微波法[8]等。超声波辅助提取技术因其具有快速破壁、加速细胞内物质溶出、能耗低、效率高等优点而成为近年来的研究热点。冻融法是利用冻结解冻过程中的冰晶作用破壁[9]。冻融和超声波处理都属物理破壁技术，具有操作简便、不破坏有效成分等共同优点。本研究针对金针菇生产的四季可均衡供应特点，以廉价易得的金针菇鲜根为原料，采用冻融辅助超声波法提取金针菇根中的蛋白质，为金针菇菇根蛋白资源的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇菇根，河南省农业科学院加工所食用菌基地提供；牛血清白蛋白，购于上海艾研生物科技有限公司；考马斯亮蓝G250、无水乙醇、磷酸等，均为国产分析纯；试验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UV 2802S型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；H2050R型高速冷冻离心机，湖南湘仪试验室仪器开发有限公司产品；DS-1型组织捣碎机，上海标本磨具厂产品；BC/BD-519HAN型冰柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司产品；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G250法[10-11]测定蛋白质含量。标准曲线制作方法如下：精确称取牛血清白蛋白0.100 g，用蒸馏水制成质量浓度为0.1 mg/mL蛋白质标准溶液。分别精确吸取牛血清蛋白标准溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL置于具塞试管中，加蒸馏水至1.0 mL，然后加入5.0 mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，放置2 min后于波长595 nm处测定吸光度。以牛血清蛋白含量（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线，得到标准曲线方程Y=8.986 3X+0.007 6，R2=0.998 4。

1.3.2 蛋白质提取工艺单因素试验

（1） 提取工艺流程。鲜金针菇菇根→清洗→打浆→浆体称量分组→单因素处理→以转速4 000 r/min离心10 min→二次提取后合并上清液→G250法检测并依据1.3.1得到的标准曲线方程计算可溶蛋白含量。

（2）反复冻融单因素试验。称取50 g浆体，分成7组并于-18℃冰柜中冷冻至完全冻结，然后取出在常温下解冻，如此反复冻融1，2，3，4，5，6次，以冻融0次为空白对照组，冻融结束后的浆体按1∶6的料液比加蒸馏水搅拌30 min抽提，以转速4 000 r/min离心10 min，二次提取后合并上清液，采用G250法检测并计算蛋白提取得率。每组试验重复3次，并计算平均值。

（3）超声波提取单因素试验。称取50 g浆体，按不同料液比（1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9）、不同超声功率（300，400，500，600，700，800 W）、不同超声时间（3，6，9，12，15，18 min），以转速4 000 r/min离心10 min得上清提取液，采用G250法检测计算蛋白提取得率。每组试验重复3次，并计算平均值。其中，每次做1个单因素变量试验，上次单因素试验得出的最佳参数作为下次单因素试验的定量参数。

1.3.3 工艺组合试验

将冻融和超声组合成冻融辅助超声波法应用于金针菇菇根蛋白的提取，提取工艺流程如下：

金针菇菇根→清洗→打浆→冻融→超声波提取→固液分离→可溶蛋白提取液。

提取参数按照单因素最佳水平，每组样品量为浆体50 g，采用G250法检测并计算蛋白提取得率。试验重复3次，计算平均值为试验结果。

1.3.4 工艺优化正交试验

为进一步优化提取工艺参数，根据单因素试验结果，选取冻融次数、料液比、超声功率、超声时间4个因素进行四因素三水平组合正交试验，按L9（34）正交表安排试验，试验采用1.3.2中的工艺流程，每组样品量为浆体50 g，采用G250法检测计算金针菇菇根蛋白提取得率，并以此为评判指标。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反复冻融对金针菇菇根蛋白提取得率的影响

反复冻融对金针菇菇根蛋白提取得率的影响见图1。

图1 反复冻融对金针菇菇根蛋白提取得率的影响

由图1可知，各试验组的蛋白提取得率都比对照组有显著增加且均差异显著。前期随着冻融次数的增加，蛋白提取得率呈快速增长趋势，冻融3，4次时达到顶峰，冻融3，4次间的蛋白提取得率无显著差异（p＜0.05），这可能因为适当次数冻融能使细胞膜的疏水键结构破裂破坏细胞膜，另一方面由于细胞内水结晶膨胀而引起细胞膨胀破裂，解冻后细胞内物质溶出，从而提高了蛋白提取得率。冻融4次后蛋白提取得率呈逐渐降低的趋势，且与冻融3，4次时的蛋白提取得率差异显著，这可能因为多次的冻融引起了蛋白的变性，进而使蛋白提取得率降低。基于简化操作和节能考虑，选择3次为冻融的最佳次数。

2.1.2 超声提取单因素试验结果

（1）料液比对金针菇菇根蛋白提取得率的影响。

料液比对金针菇菇根蛋白提取得率的影响见图2。

称取50 g浆体，按不同料液比（1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9），在超声功率400 W下处理5 min，以转速4 000 r/min离心10 min得上清提取液。由图2可知，前期随着料液比的增大，金针菇菇根蛋白提取得率呈快速增长趋势，料液比达1∶7以后增长趋缓。料液比1∶7，1∶8，1∶9三者间的蛋白提取得率差异不显著（p＜0.05），考虑节水和后续缩短浓缩时间的需求，选择1∶7为最佳料液比。

图2 料液比对金针菇菇根蛋白提取得率的影响

（2）超声功率对金针菇菇根蛋白提取得率的影响。

超声功率对金针菇菇根蛋白提取得率的影响见图3。

图3 超声功率对金针菇菇根蛋白提取得率的影响

称取50 g浆体，按料液比1∶7，在不同超声功率（300，400，500，600，700，800 W） 下处理5 min，以转速4 000 r/min离心10 min得上清提取液，检测计算金针菇菇根蛋白提取得率。由图3可知，随着超声功率的增大，蛋白提取得率呈先增高后降低的趋势，超声功率600 W时蛋白提取得率最高达0.752%。分析原因是在一定功率内，随着超声功率的逐渐加大，大量的声能转化为弹性波形式的机械能，引起局部剪切梯度，使细胞破碎，促进细胞内物质的溶出，从而提高了蛋白提取得率。继续增加超声功率时，过强的“空化效应”能导致部分成分的破坏，从而使蛋白提取得率降低[12-13]。因此，选择600 W为最佳超声功率。

（3）超声时间对金针菇菇根蛋白提取得率的影响。

超声时间对金针菇菇根蛋白提取得率的影响见图4。

图4 超声时间对金针菇菇根蛋白提取得率的影响

称取50 g浆体，按料液比1∶7，超声功率600 W，超声处理一定时间（3，6，9，12，15，18 min），以转速4 000 r/min离心10 min得上清提取液，检测计算蛋白提取得率。由图4可知，超声时间对金针菇菇根蛋白提取得率的影响呈先快速增长后逐渐降低的走势，超声时间9 min时蛋白提取得率最高为0.797%且与6，12 min差异显著（p＜0.05）。分析可能原因是在适宜的超声时间内超声逐步引起细胞破裂而促使了蛋白的溶出，使得率逐步升高。但随着超声时间的延长，累积的超声波作用能引起金针菇菇根蛋白的变性甚至降解，从而导致提取得率逐步降低。因此，选择9 min为最佳超声时间。

2.2 工艺组合试验结果

按照1.3.2工艺流程，参数为单因素试验最佳水平即冻融次数3次，料液比1∶7，超声功率600 W，超声时间9 min，以转速4 000 r/min离心10 min得上清提取液，检测计算金针菇菇根蛋白提取平均得率为1.02%，比超声提取单因素试验最高得率0.797%（基于超声波提取各最佳单因素水平）提高了28.0%，增长幅度较大，这说明冻融联合超声波法更有利于金针菇根中的蛋白提取。

2.3 工艺优化正交试验结果

正交试验因素与水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素与水平设计

表2 正交试验结果

由表2中的极差R可以看出，影响金针菇菇根蛋白提取得率的各因素主次顺序是超声功率＞冻融次数＞料液比＞超声时间，即C＞A＞B＞D。由表2中的因素水平K值可以看出，冻融辅助超声波法提取金针菇菇根蛋白的最佳工艺水平组合为A2B3C3D3，即冻融次数3次，料液比1∶8，超声功率700 W，超声时间11 min，经测定此最佳工艺条件下的蛋白提取得率为1.31%。此得率较2.2工艺组合中的蛋白提取得率1.02%提高了28.4%，说明正交优化效果良好。

3 结论

试验结果表明，冻融和超声组合更有利于金针菇菇根中蛋白的提取。采用冻融辅助超声波法提取金针菇菇根蛋白的工艺中，影响蛋白提取得率的主要因素依次为超声功率、冻融次数、料液比和超声时间。通过正交试验优化得到的最佳提取工艺参数为冻融次数3次，料液比1∶8，超声功率700 W，超声时间11 min；在此最佳工艺条件下的金针菇菇根蛋白提取得率为1.31%。冻融辅助超声波提取为纯物理提取方法，整个提取中无任何化学添加，提取工艺安全环保，具有良好的实际推广价值，为金针菇根的回收利用提供了一种方法和思路。

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Process Optimization of Protein Extraction from Flammulina Velutipes Root Using Ultrasound Assisted by Freezing and Thawing

ZHU Guangcheng，WEI Shuxin，LU Fengyin
（Institute ofAgricultural Products Processing，He'nan AcademyofAgricultural Science，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

To make full use and enhance the value of postharvest Flammulina velutipes，the root as material is studied on protein extraction using ultrasound assisted by freezing and thawing.Based on single factor and combination experiments，the freezing and thawing times，solid-liquid ratio，ultrasonic power，ultrasonic time are optimized using protein yield as evaluation index.The optimum extraction parameters obtained by orthogonal test are as follows：the freezing and thawing 3 times，solid-liquid ratio 1∶8，ultrasonic power 700 W，ultrasonic time 11 min.Under the optimized conditions，the extraction rate of protein is 1.31%.The extraction of ultrasound assisted by freezing and thawing is a pure physical method without any chemical additives，safe and environmentally friendly process with good practical promotional value.

Flammulina velutipes root；freezing and thawing；ultrasound；protein；extraction

TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.006

1671-9646（2016）11a-0018-04

2016-08-01

河南省农业科学院财政预算项目（2012035）。

朱广成（1970—），男，大专，助理研究员，研究方向为农产品加工技术。