大竹蛏幼贝滤水率的响应面法分析

姜 北，董 颖，高 杉，王 摆，曹 琛，张 乾，郝咏芳，王永波，周遵春

( 1. 辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023； 2. 营口市水产科学研究所，辽宁 营口 115003；3. 营口现代渔业科技产业园，辽宁 营口 115001 )

大竹蛏幼贝滤水率的响应面法分析

姜 北1，董 颖1，高 杉1，王 摆1，曹 琛2，张 乾2，郝咏芳2，王永波3，周遵春1

( 1. 辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023； 2. 营口市水产科学研究所，辽宁 营口 115003；3. 营口现代渔业科技产业园，辽宁 营口 115001 )

采用三因素三水平中心组合试验设计方案，研究光照度、盐度、pH及三者交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响，并进行响应面分析，探寻大竹蛏幼贝最适生长条件组合，构造大竹蛏幼贝滤水率模型。试验期为30 d，试验光照梯度为2000 lx、1000 lx、0,盐度梯度为30、25、20，pH梯度为9.00、8.00、7.00。结果显示，光照度、盐度及 pH 三者对大竹蛏幼贝滤水率有显著交互作用(P<0.05)。通过Design-Expert 8.0软件对数据进行二次多元回归，拟合得到大竹蛏幼贝滤水率y对编码自变量A(光照度)、B(盐度)和C(pH)的二次多元回归方程:y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821)，软件模拟最适大竹蛏幼贝生长的条件组合为光照度1109.17 lx，盐度25.12，pH 7.89。

大竹蛏；光照度；盐度；pH；滤水率；响应面分析

大竹蛏(Solengrandis)属软体动物门、双壳纲、异齿亚纲、帘蛤目、竹蛏科，主要分布于我国沿海潮间带地区[1]，营埋栖生活，主要以海水中有机碎屑和微型浮游生物为食[2]。为有效保护和利用野生资源并满足大竹蛏的市场需求，开展大竹蛏苗种规模化繁育及增殖放流工作势在必行。

滤水率是滤食性双壳贝类能量学的重要参数和生理指标，可用于推算海区贝类的养殖容量和生长余力。滤水率主要受溶解氧、温度、盐度、饵料丰度、酸碱度、沉积环境等多因素的影响[3]。国内外文献报道主要通过温度、盐度、pH、饵料含量等单因素来考察双壳贝类滤水率[4-7]，有关工厂化苗种繁育过程中，环境条件对于大竹蛏幼贝滤水能力的研究鲜见报道。

响应面法是一种解决多变量问题的数学统计分析方法，主要通过提供合理的试验设计和数据统计分析、评价多种变量之间的交互作用而建立数学模型和三维立体响应曲面图形，并最终得出最优参数组合的多元回归方程[8]。目前响应面法在药物开发、食品以及环境微生物等领域中的应用报道较多[9-14]，在水产动物尤其是贝类研究上应用较少。桑士田等[15]对菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)生长环境条件进行优化分析，朱晓闻等[16]研究了温度、盐度和pH对马氏珠母贝(Pinctadamartensii)生长的作用，Robert等[17]指出当解释变量较多时，只有研究多变量之间的交互作用才更有实际意义。笔者利用响应面法研究pH、盐度、光照度三因素及其联合效应对大竹蛏幼贝滤水率的影响，并利用多元回归方程模拟大竹蛏幼贝最优生长环境条件，以期为大竹蛏养殖条件优化、工厂化人工苗种繁育和增殖放流提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大竹蛏幼贝取自营口市水产科学研究所贝类研发基地，选取当年同批、规格一致的健康苗种，随机测量30个个体，平均壳长为(10.00±0.08) mm，洗净表面的污物，在水槽中暂养7 d，连续充气，每日等量(约3.0×105个/mL)投喂小球藻(Chlorella)、扁藻(Tetraselmischui)和盐藻(Dunaliellasalina)的混合饵料并全量换水一次，海水温度24 ℃，盐度24，pH 7.9，光照度0～2000 lx，底质为4 cm厚泥沙，试验前移入经500目筛绢和脱脂棉过滤的新鲜海水中饥饿3 d备用。

1.2 试验方法

采用三因素三水平的中心组合试验方案进行响应面分析，方案见表1、表2。

在避光条件下通过光度计和可调灯光控制光照梯度，用静置淡水和天然海水按比例配制试验所需盐度，用氢氧化钠和盐酸调配pH。试验容器为60 L水槽，每个水槽放置600个幼贝，设置3个平行组。所用海水提前3 d逐级微调配好盐度和pH，稳定3 d后再进行试验，试验开始时投喂3.0×105个/mL的小球藻(预试验得出此密度下滤水率最高)，2 h后测量各组滤水率。

表1 响应面三因素三水平试验设计

表2 响应面分析方案与试验结果

1.3 滤水率计算

悬浮颗粒有机物测定方法：将孔径1.2 μm的GF/C玻璃纤维滤膜经450 ℃灼烧6 h，并标记称量质量。取一定体积的水样，用经上述烘干的GF/C玻璃纤维滤膜进行抽滤，用约10 mL甲酸铵(0.5 mol/L)漂洗掉滤膜上的盐分，再经110 ℃烘干后电子分析天平称量质量(m110)，最后经450 ℃灼烧6 h后称量质量(m450)。

悬浮颗粒有机物含量=m110-m450

滤水率=V×ln(C0/Ct)/n·t

式中，滤水率指单位时间的平均滤水率[mL/(个·min)]，V为试验容器体积(mL)，n为试验个体数量，C0和Ct分别为试验开始和t时间水体中悬浮颗粒有机物含量。

1.4 数据分析

使用SPSS 22.0和Design-expert 8.0软件进行试验设计和数据分析，以光照度(A)、盐度(B)和pH(C)为自变量，滤水率(y)为应变量建立模型方程，并对滤水率的最佳条件进行预测和优化，回归拟合大竹蛏幼贝滤水率模型曲线并做图。

模型方程滤水率y=k+x1A +x2B+x3C+x4A×B +x5A×C+x6B×C+x7A2+x8B2+x9C2+ε。

式中,k为截距，x1、x2、x3分别为光照度、盐度和pH的一次效应；x4、x5、x6分别为光照度、盐度和pH之间的交互作用；x7、x8、x9分别为光照度、盐度和pH之间的二次效应；ε为残差，假定其服从均值为0的正态分布。

通过 ANOVA 分析确定回归方程模型及各试验因素的显著性，给出决定系数以考察模型的拟合优度，模型中各项效应采用最小二乘法进行估计并采用F统计量进行显著性检验，显著水平设定为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 光照、盐度和pH交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响

利用 Design-Expert 8.0软件对表 2 数据进行二次多元回归拟合并得出二次回归方程的等高线和响应面，光照和盐度的交互作用以及光照和 pH的交互作用均对大竹蛏幼贝滤水率的影响明显(图1，图2)，盐度和pH的交互作用对大竹蛏幼贝滤水率影响不明显(图3)。随着三因素的变化大竹蛏幼贝滤水率存在最佳范围。

当光照度由0升至1000 lx时，滤水率达到最大，但当光照度继续增至2000 lx时，滤水率逐渐下降；当盐度由20升至25时，大竹蛏幼贝滤水率逐渐达到峰值，但当盐度由25升至30时，滤水率开始降低；pH由7.00升至8.00，滤水率逐渐增加到峰值，当pH 由8.00升至9.00时，滤水率开始下降。因此，根据模型可以预测出大竹蛏幼贝的最适摄食条件为光照度1000 lx、盐度25和pH 8.00。

图1 光照度和盐度交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响

图2 光照度和pH交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响

图3 盐度和pH交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响

2.2 大竹蛏幼贝滤水率条件拟合优化

大竹蛏幼贝滤水率预测值y对编码自变量 A(光照度)、B(盐度) 和 C(pH)的二次多项回归方程：

y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C+0.022AB-0.065AC-0.048BC-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9874，Adj r2=0.9713，pred r2=0.8472)；

大竹蛏幼贝滤水率预测值y对实际值自变量A、B和C的二次多项回归方程：

y=-60.30975+0.00126025A+1.3835B+11.11075C+0.0000045AB-0.000065AC-0.0095BC-0.0000003845A2-0.02608B2-0.6845C2，回归方程的方差分析结果见表 3。

表3 回归模型的方差分析

注：r2=0.9874，Adj r2=0.9713，pred r2=0.8472，偏差系数=11.85%.

对F值、P值、r2、校正可决系数Adj r2、偏差系数进行分析，进而检验模型的显著性，F值越大越好[18-19]。表3的方差分析结果表明,F值为61.14，P<0.0001，模型的决定系数为0.9874，说明该模型拟合效果较好，能解释98.74%的变化，因此模型可以预测出3个因子在试验设计范围内的组合，但模型 pred r2与 Adj r2相差较大，说明模型可以进一步优化。偏差系数表示试验的精确度，偏差系数越大，试验的可靠性越低，本试验的偏差系数仅为11.85%，说明试验操作可信。

由方差分析可知，光照和pH 的一次效应影响显著(P<0.05)，光照、盐度、pH 的二次项对模型的影响极显著(P<0.01)，但三因素间交互作用不显著(P>0.05)，因此需要将交互作用项剔除并重新对模型进行回归得到修正后大竹蛏幼贝滤水率预测值y对编码自变量 A、B和C 的二次多项回归方程：y=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821，Adj r2=0.9713，pred r2=0.9363)，决定系数为0.9821，说明该模型能解释98.21%的变化，Adj r2和pred r2相差不大，说明模型拟合度良好；修正后大竹蛏幼贝滤水率预测值y对实际值自变量 A、B 和 C 的二次多项回归方程：y=-58.00225+0.00085275A+1.312B+10.80825C-0.0000003845A2-0.02608B2-0.6845C2，修正后的回归模型的方差分析结果见表 4。

表4 修正后回归模型的方差分析

注：r2=0.9821，Adj r2=0.9713，pred r2=0.9363，偏差系数=11.85%.

表4的单因子线性回归结果表明,pH对大竹蛏幼贝滤水率的影响极显著(P<0.01)，光照对滤水率产生显著影响(P<0.05)，盐度对滤水率无显著影响(P>0.05)。3个因素的二次项能够对滤水率产生极显著影响(P<0.01)。因此，通过 Design-Expert软件对大竹蛏幼贝最优生长条件进行分析预测并建立优化模型，得出三因素最优点(A，B，C)的代码值为(0.109、0.03、-0.105)，即(1109.17 lx、25.12、7.89)。此时滤水率可以达到最大值1.63672 mL/(个·min)。

2.3 模型验证

运用Design-Expert软件构建的响应面模型得出的大竹蛏幼贝滤水率最优条件，选择与试验期间相隔一个月的同规格大竹蛏幼贝进行验证试验，试验为期30 d，设计3个平行试验组，试验预测结果和实际验证结果见表5。验证结果表明响应面模型分析方法可靠。

表5 试验结果验证

3 讨 论

3.1 光照度对大竹蛏幼贝滤水率的影响

光照可直接或间接影响水生生物的生理状态和生活规律，同时水生生物摄食的昼夜节律现象也广泛存在[20]。光照度影响贝类滤水率方面的研究较少，早在20世纪70年代Maru[21]发现，虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)幼贝摄食的昼夜规律明显，光照时间和强度直接影响其滤水强度和时间，滤水率与光照度呈反比关系。杜美荣等[22]的研究指出，栉孔扇贝(Chlamysfarreri)幼贝的滤水率同样具有强烈的昼夜变化，白天滤水率较低，夜间具有较高的滤水率，昼夜差异显著。有报道指出，缢蛏(Sinonovaculaconstrzcta)的摄食行为昼夜节律性明显[23-24]。另外，据吴桂汉等[25]报道，菲律宾蛤仔幼贝夜间的摄食率明显高于白昼，昼夜间摄食率差异显著。

本研究结果表明，大竹蛏幼贝的滤水行为与光照度具有直接相关性。试验期间的大竹蛏幼贝最大滤水率出现在光照度1100 lx时，最小滤水率出现在光照度0 lx和2000 lx时。双壳贝类主要以浮游动植物和有机碎屑为食，而浮游植物的繁殖主要依靠光合作用[26]，双壳贝类的视觉不发达，主要依靠外套膜上的色素细胞和外套眼进行感光[27]。因此，双壳贝类摄食习性的昼夜差异很有可能是为了适应饵料生物的昼夜变化，是对光照度、温度、潮汐等生态因子周期性变化的生态响应[22]。本研究中大竹蛏幼贝壳长约10 mm，其光感受器的发育接近于成贝，昼夜节律习性逐步形成。Holt等[20]也发现，砗磲(Tridacnidae)表面的虹彩细胞会根据光线的变化而调节参与“光合转化”的效率，从而影响其自身的生长和摄食情况。但也有学者发现，有些贝类的摄食强度与昼夜变化无关[28]。

3.2 盐度对大竹蛏幼贝滤水率的影响

盐度对贝类在自然界中的分布起着决定性作用，生活在近岸海区潮间带的贝类需要调节自我生理状态以适应海水盐度的周期性变化[29]。在适宜渗透压和盐度条件下，贝类摄食和滤水能力旺盛，此时产生的能量主要用于机体的新陈代谢[16]。盐度主要通过改变渗透压来影响贝类的滤水、附着、呼吸、心跳等生理活动。贝类会在外界盐度剧烈变化时采取关闭贝壳或水管等方式降低机体与外界的水流交换，从而保护机体免受盐度剧变带来的伤害。贝类对盐度变化的适应能力还与贝类规格、形态结构、生理状态及生理调节机制密切相关[30-32]。Farmer等[33]研究发现，在适宜的盐度范围内，贝类主要通过调节体内游离氨基酸含量来适应外界环境渗透压的改变，当外界盐度超出贝类适宜范围时，调节机制失效并导致死亡[34]。盐度一次效应对滤水率的影响不显著(P>0.05)，其原因可能是试验盐度超出适宜范围或设计范围过大，或者大竹蛏幼贝在此盐度范围内的渗透压调节能力能够满足自身摄食和滤水需要。吴杨平等[35]报道中指出大竹蛏幼贝适盐范围为20～32。

本次试验的盐度一次效应对大竹蛏幼贝滤水率影响不显著的原因可能是试验所用幼贝为营口沿海土著大竹蛏的后代，亲贝所在海区盐度长期为25，并且幼贝从孵化到成熟都在此盐度范围内，已经得到盐度驯化。盐度的二次效应对大竹蛏幼贝滤水率具有极显著影响(P<0.01)，说明最佳滤水率盐度为20～30，表明大竹蛏幼贝在盐度20～30时的代谢活动较强，其自然生活条件与这一盐度水平相近。另外，光照和盐度交互作用及盐度和pH交互作用显示出滤水率存在拐点，这与相关研究结果类似[15-16,36]。

3.3 pH对大竹蛏幼贝滤水率的影响

Bamber[37]的研究与本研究结果相似，pH对双壳贝类的滤水率具有显著影响，在适宜的pH范围内具有较高滤水率[38]。栗志民等[39]发现，超出耐受阈值的pH会抑制鳃纤毛组织细胞正常生长和鳃纤毛的活力，过低的pH会麻痹贝类并使贝壳松弛，损坏贝类的正常摄食能力。此外，pH过低还会改变贝类生理学状态，从而降低摄食和生长性能[40-42]。

本试验结果显示，pH的一次效应和二次效应均对大竹蛏幼贝滤水率的影响极显著(P<0.01)，这与潘鲁青等[6]在研究缢蛏滤水率时发现最佳滤水率出现在pH 7～9的研究结果一致。大竹蛏幼贝滤水率随pH变化出现先升后降的趋势，这与文蛤(Meretrixmeretrix)、剑状矛蚌(Lanceolariagladiola)等贝类的研究结果相似[38-39]。pH在7和9时，大竹蛏滤水率均出现低值，说明过高或过低的pH均会对大竹蛏幼贝的摄食能力造成负面影响[43]。

3.4 光照度、盐度和pH交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响

交互效应的强弱和大小由等高线形状是否接近圆形来进行判别，椭圆形表示双因素间具有交互作用，圆形表示双因素间无交互作用。光照度和盐度的交互作用及光照度和pH的交互作用的等高线接近椭圆，表示双因素间的交互作用明显；盐度和pH的交互作用的等高线趋近圆形，表示双因素间无交互作用或交互作用很弱。

盐度和pH的交互作用对大竹蛏幼贝滤水率的影响不明显，这可能与pH和盐度的影响机制不同有关，pH是通过影响贝类体内蛋白水平而控制能量代谢，而盐度是改变渗透压来影响滤水能力，它们是两个相互独立的过程。Ginger等[44]的报道也指出，pH和盐度的交互作用对太平洋牡蛎(Crassostreagigas)幼贝的生长影响不显著。

光照度和 pH 的交互作用影响大竹蛏幼贝的滤水率，笔者认为，可能与pH在改变机体抗氧化酶活力和脂质过氧化作用的途径有关，持续光照会直接影响水体温度和二氧化碳含量。朱晓闻等[16]研究马氏珠母贝幼贝的滤水率时发现，pH和温度的联合效应显著影响幼贝滤水率。Matozzo等[45]研究鸡帘蛤(Chameleagallina)和紫贻贝(Mytitidaegalloprovincialis)时发现,温度和pH的联合作用对双壳贝类的抗氧化反应和脂质过氧化作用影响显著，同时还发现,水体中二氧化碳的含量和pH的联合作用也会影响贝类的酶活性。此外，光照通过海水中浮游植物的光合作用而间接改变海水中溶解氧和二氧化碳的含量，从而影响到海水的 pH。Sui等[46]报道，海水pH和溶解氧的交互作用会影响厚壳贻贝(M.coruscus)的摄食和生长，因此光照和 pH 之间存在着一定的间接关系。

光照和盐度的交互作用对大竹蛏幼贝滤水率有一定影响，其原因可能为光照时间和强度会改变水体pH，从而改变水体中离子的浓度，而盐度通过影响渗透压而调节离子交换。有研究表明，随着盐度、pH的升高，贝类滤水率逐渐达到峰值，然后逐渐下降，这与本试验的研究结果一致[38]。另外，光照会影响水体中溶解氧和CO2水平，已有报道指出，溶解氧和盐度的交互作用会影响贝类的滤水率、吸收效率、呼吸率和生长率[47]。CO2和盐度的协同作用会增加水体酸化趋势，影响离子和酸碱比率以及贝类对海水酸化的自我修正机制[48]。

相关研究中，栉孔扇贝幼贝的最适光照度约为1000 lx(凌晨)[22]，背角无齿蚌(Anodontawoodiana)的滤水率也具有一定的昼夜节律，最大滤水率出现在18:00(约1000 lx)[49]。包永波等[50]亦认为,温度是贝类摄食率昼夜变化节律的主要原因，光照度为1000 lx时的温度比较适宜，海水的黏滞性降低和贝类的侧纤毛运动能力提高，摄食率也随之升高；桑士田等[15]发现菲律宾蛤仔幼贝的最适盐度为23.35，潘鲁青等[6,25]认为,盐度为22～30时,贝类的摄食率最高，盐度低于22和高于30时,摄食率显著下降；朱晓闻等[16]认为,马氏珠母贝幼贝的最适 pH 为8.09。本试验模型优化得出的大竹蛏幼贝滤水率的最佳组合为光照强度1109.17 lx、盐度25.12、pH 7.89，基本符合海洋贝类的生长习性。

目前针对贝类滤水率的研究较少考察环境因素的联合作用及二次效应。本试验通过分析光照、盐度和 pH的交互作用对大竹蛏幼贝滤水率极显著(P<0.01)而构建的模型拟合度很高，说明该模型能够很好的解释大竹蛏幼贝滤水率随环境因素的变化，可以用于预测实际生产。

此外，研究大竹蛏生长的最佳优化条件时还应进一步考虑饵料种类和密度、贝类密度和规格、底质条件、海水流速、溶氧水平、试验时间等交互作用对滤水率的影响。

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OptimizationofFiltrationRateinJuvenileRazorClamSolengrandisbyResponseSurfaceMethodology

JIANG Bei1，DONG Ying1，GAO Shan1，WANG Bai1，CAO Chen2，ZHANG Qian2，HAO Yongfang2，WANG Yongbo3，ZHOU Zunchun1

( 1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023，China；2.Yingkou Fisheries Institute，Yingkou 115003，China；3. Yingkou Modern Fishery and Technology Industrial Park，Yingkou 115001，China )

The joint effects of illumination，salinity and pH on filtration rate of juvenile razor clamSolengrandiswere studied using Box-Behnken experimental design and response surface methodology ( RSM ) under laboratory conditions, aiming to quantifying the relationship between the filtration rate and the above three factors, and to the optimal factor combination through statistical optimization approach.The results showed that there were significant interaction effects between illumination and salinity, and between illumination and pH on the filtration rate of razor clam juveniles (P<0.05).The multivariate non-linear model is described asy=1.62+0.084A+0.04B-0.14C-0.38A2-0.65B2-0.68C2(r2=0.9821), the optimal conditions for filtration were found under conditions of illumination of 1109.17 lx, salinity of 25.12 and pH=7.89. The findings indicate that the proposed model is reasonably accurate and can be used for describing and predicting the growth features of juvenile razor clam in different environmental factors．

Solengrandis；illumination；salinity；pH；filtration rate；response surface methodology

S968.31

A

1003-1111(2016)04-0313-08

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.001

2016-01-05；

2016-03-10.

辽宁省海洋与渔业厅项目(201603，201301)；辽宁省科技计划项目(2015103044).

姜北(1982—)，男，助理研究员；研究方向：海洋生态学．E-mail:jiangbei1983@163.com.通讯作者：周遵春(1967—)，男，研究员，博士；研究方向：海洋生物学．E-mail: zunchunz@hotmail.com.