大肠杆菌动力与侵袭力的关系*

蒲忠瑶， 汤　沛， 王　帅， 丁淑琴

(宁夏医科大学，宁夏银川 750004)



大肠杆菌动力与侵袭力的关系*

蒲忠瑶， 汤沛， 王帅， 丁淑琴

(宁夏医科大学，宁夏银川 750004)

[摘要]目的：比较实验室和医院的大肠杆菌动力大小及与其侵袭力是否有关系。方法：用嗜热菌蛋白酶分离单个小肠上皮细胞，再用大肠杆菌侵袭小肠上皮细胞，计数胞体中所含大肠杆菌个数来反应侵袭力的大小。细菌培养后通过穿刺线运动直径判断细菌动力大小。结果：医院菌实验组平均每个细胞内有11个细菌，实验室菌实验组平均每个细胞内有5个细菌，两组经秩和检验差异有统计学意义(Z=-4.837，P=0.000)。实验室细菌动力强于医院细菌。结论：医院大肠杆菌虽然动力弱但其侵袭力强。

[关键词]大肠杆菌；侵袭力；动力；侵袭实验；组织块分离培养法

在大肠杆菌中，不同细菌的运动性和毒力因子之间有着复杂的相互作用，大肠杆菌鞭毛对细菌向宿主细胞移动很重要。有研究表明高活力菌株在自发性细菌性腹膜炎中比其他菌株致病力强。各种类型的大肠杆菌感染与细菌的运动差异、毒力、对抗生素的敏感性有关。低动力大肠杆菌导致肠外感染是由于毒力较强[1]。大肠杆菌的侵袭力大小主要与大肠杆菌的菌毛、肠毒素、侵袭酶有关。鞭毛是细菌体表重要的附属结构之一，一直以来仅被简单地当做运动器官。但近几年来,随着对鞭毛结构和致病性作用的深入研究，发现鞭毛及其运动性可促进细菌对于宿主细胞的黏附与侵袭，在细菌生物被膜形成过程中起重要作用，与细菌毒力因子的分泌也密切相关，并且鞭毛素蛋白能通过与细胞上Toll样受体5结合而诱导机体产生炎性反应[2]。大肠杆菌的动力与侵袭力的关系尚未见文献报道。本文旨在探讨大肠杆菌的侵袭力与动力的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物ICR雌性清洁级小鼠，4周龄，购自宁夏医科大学动物实验中心。

1.1.2实验试剂 嗜热菌蛋白酶来自上海信裕生物科技有限公司;DMEM-F12培养液、DPBS培养液、RPMI-1640培养基均来自赛默飞世尔生物化学制有限公司；苄卡青霉素、硫酸庆大霉素霉素来自新泰生物制剂有限公司；硫酸链霉素来自西安国安生物科技有限公司；小牛血清来自上海世峰生物科技有限公司。

1.1.3菌株医院大肠杆菌由宁夏医科大学总医院医学检验中心提供，实验室大肠埃希菌(ATCC24922)由中国药品生物制品检定所提供。

1.2方法

1.2.1细胞分离实验(1)培养皿的制备：取一次性培养皿加入质量分数为0.2 %的明胶铺满皿低，置于37 ℃作用30 min后取出，吸弃明胶，用DPBS液洗3次，吸弃DPBS后备用。(2)上皮细胞前处理：在无菌条件下取出小鼠小肠用DPBS液清洗数次,直至上清液清晰，再用含青霉素300 U/mL和链霉素0.3 g/L的无血清DMEM-F12清洗数次，再用剪刀将肠段剪成细小碎块用无血清的DMEM-F12清洗后，经1 200 r/min离心3 min，弃上清液取沉淀备用。(3)组织块培养：将前处理后的肠块剪成<1 mm的碎片，加无血清DMEM-F12清洗，用移液管反复吹打，1 200 r/min离心3 min；用DPBS反复清洗组织块，直至上清液清澈；吸去上清液后，取适量沉淀平铺于皿底，加少许小牛血清，倒置培养皿，于37 ℃和5 %体积分数CO2培养箱中培养，8 h后加完全培养液继续培养[3]。(4)嗜热菌蛋白酶消化：向前处理沉淀中加入适量的嗜热菌蛋白酶37 ℃消化30 min,期间每隔5 min震荡1次，1200 r/min离心3 min后弃上清液，沉淀用适量完全培养基重悬，用孔径2.84 mm的尼龙网过滤；取适量滤液接种于培养皿中，培养48 h后换液。

1.2.2细菌筛选经细菌培养后分离出两种单个菌落，分别来自医院和实验室(即医院菌实验组和实验室菌实验组)，两菌经过纯培养后制备菌液备用。

1.2.3侵袭实验(1)菌液的制备：制备菌液时要注意控制渗透压。取单个大肠杆菌菌落接种于液体培养基中，经过8 h培养，混匀后加入生理盐水做1：50稀释后备用。(2)大肠杆菌侵袭肠上皮细胞将稀释菌液和细胞悬液混合，经37 ℃培养3 h后，加含100 μg /mL庆大霉素的1640液2 mL，37 ℃培养1 h。用RPMI1640洗3次，取出盖玻片,晾干，甲醇固定15 min，吉姆萨氏染液染色3～4 h,用蒸馏水漂洗1次，干燥后于显微镜油镜下计数50个细胞内侵袭的细菌数，计数其平均值。医院菌组和实验室菌组均用生理盐水代替菌液为对照组。

1.2.5统计学分析用SPSS 17.0软件进行数据录入并行统计分析。两样本均数比较采用秩和检验。

2结果

实验室菌沿穿刺线运动直径约8 mm，医院菌沿穿刺线运动直径约2 mm[1]，说明实验室细菌动力强于医院细菌。两个实验组肠上皮细胞内大肠杆菌呈弥散性分布，医院菌实验组平均每个细胞内有11个细菌，实验室菌实验组平均每个细胞内有5个细菌，两组经秩和检验差异有统计学意义(Z=-4.837，P=0.000)，说明医院株大肠杆菌较实验室大肠杆菌株侵袭力强。而两个对照组在镜下小肠细胞中均看不到细菌。

3讨论

大肠杆菌有周鞭毛，能运动，无芽胞。它是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和维生素K，能分泌有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病，但当大肠杆菌侵入人体消化道外的部位时，可引起感染。大肠杆菌的主要致病物质为粘附素、外毒素、侵袭性酶等。

本文用嗜热菌蛋白酶分离单个小肠上皮细胞，再用大肠杆菌侵袭小肠上皮细胞计数胞体中所含大肠杆菌个数来反应侵袭力的大小。结果说明医院株大肠杆菌菌株较实验室大肠杆菌株侵袭力强。分析原因，我们推测医院来源的大肠杆菌侵袭力强是因为它来自于人体，故致病力强，而实验室菌株经过多次传代培养后致病力减弱所致。至于医院菌株的动力较实验室菌株弱，可能与培养基、菌液、环境等诸多因素有关。

参考文献

[1]Kao CY， Lin WH，Tseng CC，et al.The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2014,33(12):2157-2162.

[2]郭志燕，周明旭.细菌鞭毛的致病性及其免疫学应用的研究进展[J].微生物学报,2014,54(3)；251-260.

[3]孙秀梅，程帆，刘维,等.四种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2014，41(5)：25-31.

Study of connection between movement and invasive ability of E.coli

PU Zhongyao，TANG Pei，WANG Shuai，DING Shuqin

(NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ABSTRACTObjective:To compare the dynamic of the E.coli in labs and the hospital, and to explore whether the dynamic has any association with the invasive ability of the E.coli.Methods:Thermolysin was used to isolate the single intestinal epithelial cells, and E.coli was used to invade the intestinal epithelial cells. Then the number of the E.coli in the epithelial cells was counted to reflect the invasive ability of the E.coli. Results:The average number of the E.coli were 11 in each cell in the experiment group of the hospital, and the average number of the E.coli were 5 in each cell in the experiment group of the labs, with difference significant between the two groups by rank sum test(Z=-4.837，P=0.000). Conclusion:The E.coli, although weak dynamic in hospital, is of strong invasive ability.

KEY WORDSE.coli; Invasive ability; Dynamic, Invasion assay; Tissue explants isolation and culture method

*基金项目：2014年国家级大学生创新性实验项目(201410752005)；2014年宁夏回族自治区大学生创新性实验项目

通讯作者：丁淑琴

(收稿日期：2015-05-16)