远东拟沙丁鱼抗氧化肽对Caco-2细胞氧化应激损伤的影响

李亚会，吉 薇，吉宏武,2,3，苏伟明,2，王晶晶

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088； 2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；3.水产品深加工广东省普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）

远东拟沙丁鱼抗氧化肽对Caco-2细胞氧化应激损伤的影响

李亚会1，吉 薇1，吉宏武1,2,3，苏伟明1,2，王晶晶1

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088； 2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；3.水产品深加工广东省普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）

对远东拟沙丁鱼（Sardinops sagax）蛋白进行蛋白酶解和膜分离，得到分子质量100～3 000 u（F1）、3 000～ 10 000 u（F2）和大于10 000 u（F3）的多肽组分。在生化水平上测定各组分对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、羟基自由基和过氧自由基清除能力；在细胞水平上，以H2O2对Caco-2细胞的毒性及细胞内抗氧化体系的影响为检测指标，筛选最适浓度的H2O2建立细胞氧化应激模型；在建立该模型的基础上，进一步检测蛋白多肽F1对氧化应激损伤细胞的修复功能。结果表明：组分F1对DPPH、ABTS、羟基自由基和过氧自由基清除能力最强，清除率分别为 56.03±0.14、86.26±0.32、38.34±1.70、54.85± 0.75；100 μmol/L的H2O2对细胞毒性作用较小，并可降低细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化物酶（POD）的活性和谷胱甘肽（GSH）的含量，增加丙二醛（MDA）的含量，细胞氧化应激模型选择H2O2浓度为100 μmol/L；在该模型条件下，F1对受损的Caco-2细胞中抗氧化体系中的GSH-Px、T-SOD、POD的活性和MDA、GSH的含量有一定恢复作用，可调节细胞中失衡的抗氧化体系。远东拟沙丁鱼多肽FⅠ对细胞氧化应激受损有一定保护作用。

远东拟沙丁鱼；抗氧化肽；Caco-2细胞；氧化应激

氧化应激（Oxidative Stress）是指细胞内产生过量的自由基或细胞内抗氧化防御系统受损导致氧自由基及其相关代谢产物聚集，最终引发多种疾病。目前，人们面临的竞争和压力越来越大，加之日益严重的环境污染，机体内自由基过量生成，产生氧化应激[1]。大量文献表明[2]，心血管疾病、老年痴呆和癌症等疾病的发生一定程度上直接或间接与氧化应激损伤有关。抗氧化物质可消除过多的氧自由基，对氧化受损细胞有一定保护作用。近几年，人们多关注源于天然产物、安全性高的抗氧化剂，如从玉米[3]、大豆[4]、牛奶[5]等酶解得到的抗氧化活性肽，牡蛎[2]、蓝圆鲹[6]、虾[7]等水产品蛋白酶解产物也是极佳的抗氧化活性肽来源。

远东拟沙丁鱼（Sardinops sagax）高蛋白，低脂肪，具有生长快、繁殖力强等[8]诸多优点，其蛋白酶解产物中含有丰富活性氨基酸[9]，具有抗氧化、抗疲劳、抗免疫等生物活性。由于远东拟沙丁鱼直接食用价值较低，通常用作鱼粉等动物饲料，造成资源浪费[10]，因此对其进行深加工以提高利用价值有重要意义。本研究对远东拟沙丁鱼进行酶解与分离，得不同分子质量的多肽组分F1～F3，测定各组分对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、羟基自由基和过氧自由基清除能力，以最适浓度的H2O2为诱导剂建立细胞氧化应激模型，检测多肽组分F1（100～3 000 u）对氧化应激损伤细胞的修复功能，为该鱼种酶解产物在保健品中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

远东拟沙丁鱼（Sardinops sagax），购于广东省湛江市水产品批发市场。

人结肠癌细胞 Caco-2 购于上海通派生物科技有限公司；胎牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、1640培养基、质量分数0.25%胰酶、青霉素、链霉素均购于GⅠBCO；噻唑蓝（MTT）、TritonX-100均购于Amresco；风味酶（14万u/g）、动物蛋白水解酶（14.5万 u/g）购于南宁庞博生物工程有限公司；其他试剂为分析纯。

主要仪器：MCO-175型CO2培养箱，美国热电公司；全波长多功能酶标仪，美国热电公司。

1.2 方法

1.2.1 远东拟沙丁鱼蛋白多肽的制备 将远东拟沙丁鱼（100 g）去头、皮、骨及内脏，清洗后绞碎，匀浆，酶解3 h（温度50℃，自然pH，分别添加质量分数0.5%的动物蛋白水解酶和质量分数0.1%的风味酶），在约95℃条件下加热10min，以4 000 r/min离心，将上清液于管式离心机中脱油，再添加活性炭脱色，过孔径250μm的筛，所得澄清液用截留分子质量为10 000 u和3 000 u的超滤膜超滤，再用反渗透膜去除小分子物质，最后得到分子质量区间分别为100～3 000 u（F1）、3 000～10 000 u（F2）和10 000 u以上（F3）的多肽样品，分别在50℃条件下旋转蒸发，冷冻、干燥后备用。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力的测定 根据文献[11]方法，将试剂比例稍作修改。将1.5mL不同浓度样品溶液与等体积含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇混匀，在室温下避光放置30min，于517 nm处测光密度（Ds）。空白组为1.5mL 体积分数95%的乙醇加入1.5mL双蒸水，用超纯水进行调零。DPPH自由基清除率Y：

式中，Ds，样品与1.5mL含0.2 mmol/L DPPH的体积分数95%乙醇反应后的光密度；D0，样品与1.5mL体积分数95%乙醇反应后的光密度；D，双蒸水和1.5mL 含 0.2 mmol/L DPPH 的体积分数95%乙醇反应后的光密度。

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力的测定 根据文献[12]，处理时间稍作修改。将1mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液与等体积2.6 mmol/L K2S2O4混合，避光静置12 h，用pH 7.4的磷酸缓冲液（PBS）稀释40～ 50倍，测734 nm处光密度，以稀释倍数不同调整光密度范围到 0.7±0.02，得 ABTS＋工作液。将1 980μL ABTS＋与20μL样品混匀，静置6min后，测定734 nm处光密度。ABTS自由基清除率Y：

式中，D0，双蒸水和ABTS＋反应后的光密度；D，样品和ABTS＋反应后的光密度。

1.2.2.3 羟基自由基清除能力的测定 根据文献[13-14]，试剂配比稍作修改。在反应体系中加入0.5mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1mL 9 mmol/L水杨酸–乙醇溶液，然后加入不同浓度样品溶液1mL、双蒸水5mL、8.8 mmol/L H2O20.5mL后，启动反应。对照组中以1mL双蒸水替换同体积的样品，于37℃条件下保温0.5 h。以双蒸水为参比液，在510 nm处测定光密度，记为DS。羟自由基清除率Y：

式中，Ds，样品光密度；D0，采用双蒸水代替样品重复上述操作；Dc，双蒸水代替双氧水溶液。

1.2.2.4 过氧自由基清除能力的测定 根据文献[4]方法，测定时间稍作修改。向4.5mL 50 mmol/L pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中加入0.2mL样品，于25℃下保温10min，再加入在25℃预热的6 mmol/L邻苯三酚0.3mL。迅速摇匀后用紫外–可见分光光度计在320 nm处每隔30 s测定光密度1次，测定5min内光密度的变化，并求出光密度变化率ΔDs；另取同上试剂，用等体积水代替样品（即含 Tris-HCl +水 + 邻苯三酚），同时以Tris-HCl缓冲液作空白对照，测定方法同上，得变化率ΔD0。过氧自由基清除率Y：

式中:ΔDs，样品光密度变化率；ΔD0，不加样品时的光密度变化率。

1.2.3 Caco-2细胞氧化应激模型的建立

1.2.3.1 Caco-2细胞培养 在无菌条件下，Caco-2细胞培养瓶中加入含体积分数10%胎牛血清和体积分数1% 双抗的1640培养基置37℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养，隔天换培养液1次。待细胞贴壁生长至容器的 80%～90%后，用质量分数0.25%胰酶对其进行消化传代，继续培养。

1.2.3.2 H2O2对Caco-2细胞毒性作用 将5×104个/mL的Caco-2细胞接种于96孔板中，每孔接种200μL。在37℃、含体积分数为5% CO2培养箱中孵育 24 h，细胞贴壁生长后分别在培养板中添加50、100、200 µmol/L的H2O2，对照组添加等体积培养基，继续孵育12、24 h后，按照MTT法测定细胞存活率。

1.2.3.3 H2O2对 Caco-2细胞抗氧化酶及非酶抗氧化物的影响 调整细胞浓度至1×105个/mL，接种到24孔板中，每孔加入1mL的细胞悬液，培养至细胞完全贴壁后进行实验。实验前吸出培养液，各孔加入0.9mL含体积分数5% FBS的培养基和0.1mL分别含0、50、100、200 μmol/L H2O2的培养基，每个浓度设置3个复孔，培养4 h后去培养液，将贴壁细胞用含体积分数1% Triton-X的PBS溶液裂解，以2 000 r/min离心10min，收集上清液即为细胞裂解液，置- 80℃下保存。

参照南京建成生物工程研究所的相应试剂盒说明书测定细胞裂解液内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.2.4 F1对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用

在 Caco-2细胞氧化应激模型建立后，测定样品F1对Caco-2细胞氧化应激损伤的影响，操作方法基本如1.2.3.3，但用 H2O2诱导氧化应激前，先加入不同浓度（100、200、400 μmol/L）的F1处理6 h，再测定细胞裂解液内 SOD、GSH-Px、POD 活性和MDA、GSH含量。

1.3 数据分析

所有实验均重复3次，结果表述为平均值±标准差，采用Origin 8.6作图和SPSS数据分析。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性的测定

多肽的浓度及分子质量是影响其抗氧化活性的两个因素。一般而言，相同浓度的多肽随着分子质量的减小，其对自由基清除能力逐渐增强[9]。图1～4可见，同一组分随着自身浓度的增加，其对各自由基的清除能力逐渐增强。在同一浓度条件下，不同分子质量区间的组分对DPPH、ABTS自由基均具有较强的清除能力（图1、2），且F1相对于组分F2、F3，清除能力更强，清除率达到55%以上。图3显示，各组分对羟基自由基的清除能力相对较低，其中F1清除能力比F2、F3稍强，F3的清除能力最差，当F3质量浓度为10mg/mL时，清除率仅约10%。图4表明，F1对过氧自由基的清除能力最强，当质量浓度为10mg/mL时，清除能力达到50%以上。综上可见，随着浓度增加，各组分对自由基的清除能力均逐渐增强，其中组分 F1对DPPH、ABTS、OH、O2自由基的清除能力最强。因此可初步判定分子质量为100～3 000 u的组分在生化水平上抗氧化活性较强。

图1 组分F1、F2、F3浓度对DPPH自由基清除能力的影响Fig.1 Effects of concentration of polypeptide F1,F2 and F3 on scavenging DPPH radical capacity

图2 组分F1、F2、F3浓度对ABTS自由基清除能力的影响Fig.2 Effects of concentration of polypeptide F1,F2 and F3 on scavenging ABTS radical capacity

图3 组分F1、F2、F3浓度对羟基自由基清除能力的影响Fig.3 Effects of concentration of polypeptide F1,F2 and F3 on scavenging hydroxyl radical capacity

图4 组分F1、F2、F3浓度对过氧自由基清除能力的影响Fig.4 Effects of concentration of polypeptide F1,F2 and F3 on scavenging peroxy radical capacity

大量研究表明，活性较强的抗氧化肽分子质量约为300～5 000 u。宋永相等[15]研究发现，分子质量小于1 000 u的海洋活性胶原肽抗氧化活性最强；WANG Bin等[13]发现，提取自贻贝（Mytilus edulis）肌肉的不同分子质量组分中，小于3 000 u的组分抗氧化活性最强；JⅠANG Haiping等[11]]亦从蓝圆鲹（Decapterus maruadsi）肌肉蛋白中分离出分子质量分别为706.8、614.7 u抗氧化活性肽。本研究结果与前人结果一致。

2.2 细胞抗氧化应激模型结果

2.2.1 H2O2对细胞生长的影响 图5可见，诱导剂H2O2在低浓度范围（50、100 μmol/L）内对细胞无明显毒害作用，细胞存活率达80%左右，但浓度为200 μmol/L时有一定毒性，细胞培养24 h后的存活率仅50%，说明H2O2对Caco-2细胞生长有一定影响，低浓度H2O2对细胞生长影响较小。目前MTT比色试验测定细胞存活率是检测细胞受氧化应激损伤程度的最常用方法[16]，因此测定H2O2对Caco-2细胞生长的影响可为其模型的建立提供依据。

图5 H2O2对细胞生长的影响Fig.5 Effect of H2O2on Caco-2 cells growth

2.2.2 不同浓度H2O2对Caco-2细胞抗氧化系统的影响 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化物酶（POD）均为细胞抗氧化防御系统中重要酶类物质，对机体内的氧化与抗氧化动态平衡极为重要。GSH-Px可促进H2O2与 GSH反应生成水和氧化型谷胱甘肽（GSSG）；T-SOD可清除超氧阴离子自由基，防止细胞受损；POD可清除细胞中的H2O2而保护细胞[17]；GSH作为一种重要的非酶抗氧化剂，在保护细胞免受氧化应激损伤方面有举足轻重的地位[18]；氧自由基过量时，常发生脂质过氧化反应，丙二醛（MDA）是脂质过氧化的最重要产物，也是细胞产生氧化应激的重要标记物。已有研究表明，H2O2不仅可攻击生物膜，还引发脂质过氧化反应，破坏生物膜的完整性，降低细胞内抗氧化酶系的活性[19]。

表1可见，添加H2O2处理后，细胞裂解液中抗氧化酶GSH-Px、T-SOD、POD活性增加，MDA含量增加，GSH含量降低。当H2O2浓度为50 μmol/L时，抗氧化酶活性及MDA、GSH含量与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；当浓度为 100、200 μmol/L时，抗氧化酶活性及MDA、GSH含量与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。表明选用高浓度H2O2处理Caco-2细胞，可使细胞产生氧化应激，对细胞内的抗氧化酶体系有一定影响，对细胞有一定损伤作用。崔志文等[20]用100 μmol/L的H2O2建立的氧化应激模型可较好地测定鼠李糖乳酸杆菌（L.rhamnosus）对H2O2诱导的氧化应激的抗氧化作用。因此选择100 μmol/L为氧化应激的诱导浓度。

表1 H2O2对Caco-2细胞中SOD、GSH-Px、POD、MDA、GSH的影响Table 1 Effects of H2O2on SOD,GSH-Px,POD,MDA,GSH in Caco-2 cells

2.3 F1对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用

经不同质量浓度的F1处理后再用100 μmol/L H2O2诱导，细胞中抗氧化酶及非酶抗氧化物的测定结果见表2。表2显示，不同质量浓度的F1对细胞中抗氧化酶体系中的各酶活性和抗氧化物质 GSH含量有一定增加作用，且随着质量浓度的增大（100～ 400 μg/mL），T-SOD、GSH-Px、POD的酶活性和GSH的含量也逐渐增大，差异有统计学意义（P ＜0.05）；当F1质量浓度为100 μg/mL时，细胞MDA含量与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），随着F1浓度增加，其对MDA的含量有降低作用（P ＜0.05），浓度越大（小于400 μg/mL），降低程度越大。

通过测定细胞中抗氧化酶含量变化来判断是否具有氧化应激保护作用。KULLⅠSAAR等[21]通过检测人体SOD及 GSH-Px的活性，判断乳酸菌发挥的抗氧化作用大小，TAO等[22]研究发现，添加鼠李糖乳酸杆菌12 h时细胞上清T-SOD、GSH-Px、CAT 活性和细胞裂解液中SOD 活性、GSH含量显著提高，初步判定鼠李糖乳酸杆菌对细胞氧化应激损伤的保护作用。本研究显示，经过 F1处理后，F1可提高抗氧化酶活性及GSH含量，降低MDA含量，表明可一定程度上调节细胞内的抗氧化系统，抑制氧化应激过程中产生的自由基，使细胞氧化损伤得到一定程度的恢复。

表2 不同浓度的F1对Caco-2细胞氧化应激损伤的保护作用Table 2 Effects of F1 on SOD,GSH-Px,POD,MDA,GSH in H2O2-induced Caco-2 cells

3 结 论

远东拟沙丁鱼蛋白酶解组分F1、F2、F3均有一定的抗氧化活性，其中分子质量最小的组分 F1（100～3 000 u）抗氧化活性最强。细胞抗氧化应激结果显示，以100 μmol/L的H2O2构建细胞氧化应激模型，F1对受损的Caco-2细胞抗氧化酶体系中的GSH-Px、T-SOD、POD活性和MDA、GSH含量有一定影响，可调节细胞中失衡的抗氧化酶体系，表明F1对氧化损伤的Caco-2细胞有一定修复功能。

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（责任编辑：刘庆颖）

Effect of Antioxidant Peptide from Sardinops sagax on Oxidative StressⅠnjury on Caco-2 Cell

LⅠ Ya-hui1,JⅠ Wei1,JⅠ Hong-wu1,2,3,SU Wei-ming1,2,WANG Jing-jing1
（1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China; 3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China）

Polypeptides with different molecular weight F1 (100 –3 000 u),F2 (3 000 –10 000 u) and F3 (＞ 10 000 u) were prepared by the proteolysis and membrane separation from Sardinops sagax.At the biochemical level,the antioxidant activity of these fractions was determined by its capacities of scavenging DPPH,ABTS,OH and O2free radicals.At the cellular level,using cell toxic and the change of intracellular antioxidant system by the H2O2as testing indexes,the cell model of oxidative stress with the optimum concentration of H2O2was established.On the basis of the model,whether F1 can repair the Caco-2 cells oxidative damage or not was detected.The results showed that F1 had the highestactivity at the biochemical level.The DPPH,ABTS,OH,and O2free radicals capacity were (56.03±0.14)%,(86.26±0.32)%,(38.34±1.70)%,and (54.85±0.75)%,respectively.The toxic Effects of 100 μmol/L H2O2on Caco-2 cell was low and the antioxidant enzyme system of GSH-Px,T-SOD,and POD activity and the content of GSH decreased but the content of MDA increased .Ⅰt is indicated that the Caco-2 cells model of oxidative stress which was established by 100 μmol/L H2O2is the best.Under the condition of the model,F1 can repair the antioxidant enzyme system of GSH-Px,T-SOD,and POD activity and the content of MDA and GSH in damaged Caco-2 cells.The final result showed that F1 could adjust cell imbalance in antioxidant enzyme system and repair oxidative stress damage.

Sardinops sagax; antioxidant peptide; caco-2 cell; oxidative stress

TQ914.2；TQ936.1+6

A

1673-9159（2016）06-0094-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.015

2016-04-19

广东省高等学校学科建设专项资金资助项目（2013CXZDA020）；广东省省部产学研合作专项资金项目（2013B090600155）；国家海洋公益性行业科研专项课（201305018）

李亚会（1989－），女，硕士研究生，研究方向为水产品深加工及贮藏工程，E-mail:13058369058@163.com

吉宏武（1962－），男，博士，教授，研究方向为海洋生物资源高值化利用,E-mail:Jihw62318@163.com