响应曲面法优化石榴皮总黄酮提取工艺

邓婷婷,李建华,肖本胜,郑琦锴,宋 阳

(湖北工程学院 生命科学技术学院， 湖北 孝感 432000)



响应曲面法优化石榴皮总黄酮提取工艺

邓婷婷,李建华*,肖本胜,郑琦锴,宋 阳

(湖北工程学院 生命科学技术学院， 湖北 孝感 432000)

为获得超声波辅助提取石榴皮总黄酮的最佳工艺条件，在采用Plackett-Burman试验筛选出影响石榴皮总黄酮提取量的关键因素，通过最陡爬坡试验确定这些因素中心值的基础上，用Design-Expert 8.0.6软件中心复合试验(Central Composite Design，CCD)模块进行响应面分析。结果表明，初始温度和提取时间在研究所设水平范围内对石榴皮总黄酮提取影响不显著；以石榴皮总黄酮提取量最大值作为优化目标，在室温下提取10 min，得到石榴皮总黄酮最佳提取工艺条件为：液料比(mL/g)82：1，乙醇分数66%，超声波功率154 W；在此条件下进行5次平行验证试验，总黄酮平均提取量为165.10 mg/g，达到理论预测值(171.22 mg/g)的96.42%，表明该工艺条件稳定可靠，提取率高，可作为从石榴皮中大规模提取总黄酮的参考。

石榴皮；总黄酮；响应曲面法；Design-expert软件

本研究在运用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验初步确定影响石榴皮总黄酮提取量的主要因素及其水平范围的基础上，运用响应曲面法优化石榴皮总黄酮超声波辅助提取工艺，为简便高效提取石榴皮总黄酮提供参考，为后续纯化及测定总黄酮成分等研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜石榴采自湖北省孝感市杨店果园，将剥下的石榴皮置于60 ℃烘箱内干燥20 h，粉碎过40目筛备用；安捷伦 Cary 60 紫外-可见分光光度计(安捷伦科技有限公司)；循环水真空泵(SHZ-III型，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(PL203型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；智能超声波清洁器(DL-480B型，上海沪粤明科学仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-4型，江苏荣华仪器制造有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线回归方程

植物提取物中总黄酮的测定一般采用亚硝酸盐-硝酸铝法[5-7]，但紫外分光光度法测定植物提取物中总黄酮更简单、 准确[8]。本研究参考王静等[10]的研究结果，以山奈酚为对照品，在265 nm波长下测定其吸光值，构建总黄酮含量标准曲线。具体的作法是：精确称取3.4 mg山奈酚对照品，用20 mL甲醇超声(功率：240 W，时间：5 min)溶解，得每1 mL含0.170 mg山奈酚的储备液。分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL储备液，用75%乙醇稀释为10 mL，摇匀，配制成浓度梯度0.0085～0.051 mg/mL的山奈酚工作液，以 75%乙醇为空白对照，在265 nm处测定不同浓度山奈酚溶液的吸光值，建立标准曲线回归方程。

1.2.2 总黄酮的提取与检测

准确称取石榴粉(过40目筛)0.5 g后，按设定的工艺参数进行超声波提取和真空抽滤，得到石榴皮总黄酮提取液。用移液器准确量取5 μL石榴皮总黄酮提取液，置于10 mL具塞试管中，加5 mL 75%乙醇摇匀，在265 nm处测定吸光度，根据回归方程和液料比，计算出每克石榴粉中总黄酮的提取量。

1.2.3 Plackett-Burman试验设计

根据以往研究经验，选取可能对超声波法黄酮提取率有影响的5个因素(初始温度、提取时间、液料比、乙醇分数、超声波功率)，每个因素取两个水平(低水平“-1”和高水平“+1”) 进行Plackett-Burman试验设计，以确定显著影响石榴皮总黄酮提取量的因素。需说明的是，由于在提取过程中超声波清洗器中的水温会不断变化，不易测定，故将其初始温度作为一个变量。表1为Plackett-Burman试验因素水平及编码。

1.2.4 最陡爬坡试验设计

根据Plackett-Burman试验的结果，选取显著影响石榴皮总黄酮提取量的因素，分别以试验值变化梯度方向为爬坡方向，以效应值的大小为最优步长，可得到最优提取条件下，响应面试验设计的中心点。

表1 Plackett-Burman试验因素水平

1.2.5 响应面试验设计

综上，在当前阶段对于老年糖尿病并发神经痛患者实施优质化护理干预方式能够提升患者的护理效果，改善患者的神经痛情况，提高患者的治疗依从性。

利用Design-Expert 8.0.6软件，根据最陡爬坡试验结果进行中心复合试验设计(Central composite design，CCD)，并对石榴皮中总黄酮的提取工艺参数进行响应面分析。

1.2.6 数据分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

以山奈酚为标准品，在265 nm条件下试验建立的标准曲线回归方程为y=86.948x- 0.0024，其中y为吸光度，x为标准品浓度，该回归方程线性决定系数R2= 0.9997，表明在试验所用浓度范围内，溶液中山奈酚含量与吸光值呈良好的线性关系。

2.1 Plackett-Burman试验方案及试验结果

Plackett-Burman试验方案及试验结果见表2，对表2中Plackett-Burman试验各因素参数及试验结果进行方差分析(表3)，构建回归方程。

表2 Plackett-Burman试验方案及试验结果

表3 Plackett-Burman试验方差分析

方差分析结果(表3)表明，在所研究的5个因素中，初始温度和提取时间对石榴皮总黄酮提取量的影响不显著(P>0.05)，在后续研究中将提取初始温度和提取时间分别固定为室温和10 min；而乙醇分数、超声波功率和液料比对石榴皮总黄酮提取量的影响达到了显著水平(P<0.05)，本研究选取这3个因素进行最陡爬坡和响应面试验。由PB试验构建的回归方程为：

总黄酮=23.90071-0.030219×温度-0.53428×时间+0.69441×液料比+0.80368×乙醇分数+0.44557×功率。

2.2 最陡爬坡试验设计及结果

在上述5个因素对总黄酮提取量的回归方程中，乙醇分数、超声波功率、液料比的系数为正，故这三个因素应从低水平向高水平进行最陡爬坡试验设计，并根据试验设计在室温下提取10 min(见表4)。

从表4可知，在第4组试验条件下，石榴皮总黄酮提取量最大，因此应以第4组中各因素的试验水平作为响应面试验的中心点，即以液料比75:1，乙醇分数70%，超声波功率134.4 W为响应面试验设计的中心点。

表4 Plackett-Burman试验方案及试验结果

2.3 石榴皮总黄酮提取的响应面试验设计及提取结果

在Plackett-Burman试验以及最陡爬坡试验的基础上，以液料比A(mL/g)、乙醇分数B(%)、取整后的超声波功率C(W)为设计参数，以提取总黄酮含量Y(mg/g)为响应值，设计响应面试验，在室温下提取10 min，可得实验结果，试验方案及结果见表5。

根据响应面试验结果，通过Design-Expert 8.0.6软件对表5中数据进行多元回归拟合及方差分析，得到多元非线性回归方程为：

Y=147.11+9.55A-4.89B+11.03C-1.99AB-1.36AC-12.19BC-2.48A2-6.88B2-18.38ABC-31.90AB2-2.68B3

式中，Y为石榴皮中总黄酮的提取量(mg/g)，多元回归方程的方差分析结果见表6。

该回归方程的决定系数(R2)为0.9898，说明该模型拟合度较好，所选试验因子对响应值有较大的影响；F检验表明，模型F=70.4559，对应的P<0.0001，表明回归模型达到极显著水平，该模型有意义；失拟项F=0.8966，对应P=0.5042>0.05，表明该回归方程没有遗漏对响应值有显著影响的项，即方程所含各项可对响应值的变化做出较全面的解释。

2.4 响应曲面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6软件得到的液料比、乙醇分数和超声波功率两两之间交互作用的3D响应曲面如图1所示。图1中分别反应液料比与乙醇分数、液料比与超声波功率、乙醇分数与超声波功率交互作用的三个响应曲面均不呈球面，表明乙醇分数、液料比和超声波功率两两之间存在着交互作用，即各因素在其他因素的不同水平上，对石榴皮总黄酮提取量的影响不同；但从响应曲面波动幅度看，反应液料比与乙醇分数、液料比与超声波功率之间的交互作用不强，乙醇分数与超声波功率间的交互作用较强；结合方差分析结果(表6)，在实际应用中应主要考虑乙醇分数与超声波功率之间的互作效应以及液料比的主效应。

表5 响应曲面试验方案及试验结果

表6 多元回归方程的方差分析

图1 因素间的交互作用

2.5 最佳工艺确定与验证

以石榴皮中总黄酮提取率最高为目的，以试验所用液料比、乙醇分数和超声波功率范围为条件，用Design-Expert 8.0.6软件进行优化预测，得到石榴皮总黄酮提取工艺的理论最优条件：液料比(mL/g)82:1，乙醇分数66%，超声波功率154 W，其理论预测值为171.22 mg/g；为检验最优条件的可靠性，在此条件下进行5次平行试验的总黄酮平均提取量为165.10 mg/g，与理论预测值相比，预测的准确率为96.42%，表明该模型的预测准确率较高。

3 结论

在所研究的可能影响石榴皮总黄酮提取率的5个因素中，液料比、乙醇分数和超声波功率对石榴皮总黄酮提取率影响较大，初始温度和提取时间在研究所设水平范围内对石榴皮总黄酮提取影响不显著。以液料比(mL/g)82:1，乙醇分数66%，超声波功率154 W为工艺条件，在室温下提取10 min，得总黄酮的平均提取量为165.10 mg/g。本工艺对提取温度和提取时间不敏感，在室温下提取10 min总黄酮的得率较高，对于从石榴皮中提取总黄酮具有一定的参考价值。

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(责任编辑：熊文涛)

Optimized Extraction Process of Total Flavonoids from Pomegranate Peel by Response Surface Methodology

Deng Tingting, Li Jianhua*, Xiao Bensheng, Zhen Qikai, Song Yang

(SchoolofLifeandScienceTechnology,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

This paper investigated the optimum technological conditions for extracting total flavonoids from pomegranate peel by ultrasound-assisted extraction process. Key factors were selected by Plackett-Burman design, which could influence total flavonoids extraction efficiency from pomegranate peel . Steepest ascent experiment was conducted to determine the optimal level of these factors. The response surfaces were delineated based on the central composite design model in Design-Expert 8.0.6 software. The results showed that the initial temperature and extraction time had no significant effect on the extraction of total flavonoids from pomegranate peel within the scope of the research institute. Extraction at room temperature for 10 min, the optimum extraction conditions were determined to maximize the extraction of total flavonoids from pomegranate peel: the liquid-to-solid ratio (mL/g), the proportion of ethanol and the ultrasonic power was 82:1, 65% and 154 W, respectively. Under this condition, 5 parallel verification tests were carried out and the average value of total flavonoids extraction (165.09 mg/g) reached 96.42% of the theoretical prediction value (171.22 mg/g). It showed that the process was reliable with higher extraction rate, so it could be used as a reference to extract the total flavonoids from pomegranate pee on large scale.

pomegranate peel; total flavonoids; response surface analysis; design-expert software

2016-08-11

湖北省大学生创新创业训练计划项目(201610528005)；湖北省教育科学规划2015年度立项课题(117)

邓婷婷(1995- )，女，湖北松滋人，湖北工程学院生命科学技术学院学生。

李建华(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程学院生命科学技术学院教授，博士，本文通信作者。

R284.2

A

2095-4824(2016)06-0020-05