苏木乙酸乙酯提取物对急性病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和相关Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

翟文姬，代洪绪，陈会君

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)



苏木乙酸乙酯提取物对急性病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和相关Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

翟文姬1，代洪绪2，陈会君3*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：观察苏木乙酸乙酯提取物对CVB3小鼠心肌细胞凋亡和相关Bc1-2、Bax蛋白表达的影响，探讨苏木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用机制。方法：50只雄性 Balb/c小鼠随机分为3组：空白组10只，苏木乙酸乙酯提取物组(苏木组)20只，模型对照组(模型组)20只。模型组、苏木组每只小鼠腹腔注射1×TCID50为10-7CVB3Nancy 标准株病毒液0.3 ml，建立VMC小鼠模型，连续给药14天，第14天无菌摘取心脏，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。采用HE染色观察心肌病理变化、TUNEL法检测心肌细胞凋亡及免疫组化法检测心肌细胞Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果：与空白组比较，模型组、苏木组小鼠心肌细胞凋亡指数增加，有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较，苏木组心肌组织中细胞凋亡指数明显减少，具有显著性差异(P<0.05)。Bcl-2蛋白在空白组呈高表达，模型组呈低表达，苏木组较模型组明显增强，呈中表达。Bax蛋白在空白组呈低表达，模型组呈高表达，苏木组较模型组明显减弱，呈中表达。结论：苏木乙酸乙酯提取物能够上调Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，抑制心肌组织的细胞凋亡, 这可能是苏木治疗病毒性心肌炎的作用机制之一。

病毒性心肌炎；CVB3；苏木乙酸乙酯提取物；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是指因嗜心肌性病毒感染引起的，以心肌非特异性间质性炎症为主要病变的心肌炎[1-3]。在病毒性心肌炎的发病过程中,病毒感染通过诱导心肌细胞表达的细胞表面分子、病毒自身基因的表达、病毒介导释放的各种炎性因子、心肌细胞损伤后释放的自身抗体、自身免疫后出现的免疫细胞表达的细胞表面分子,激活宿主细胞凋亡相关基因启动导致心肌细胞凋亡[4-5]。研究发现[6]，Bcl-2、Bax是细胞凋亡过程中的一类重要的调节蛋白，促凋亡蛋白Bcl-2表达下调及促凋亡蛋白Bax表达增加，是其受到外因刺激后诱导细胞凋亡的机制。本研究通过观察苏木乙酸乙酯提取物对急性病毒性心肌炎小鼠的心肌病理变化、心肌细胞凋亡和相关Bc1-2、Bax蛋白表达的影响，探讨苏木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用机制，为研究苏木对病毒性心肌炎的治疗作用奠定理论依据。

1 实验材料

1.1 动物

4周龄近交系纯种健康雄性Balb/c小鼠50只，体质量14～16 g，(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号为SCXX吉2011-0004)饲养在恒温(25±3)℃、恒湿(50±5)%的动物实验室内。

1.2 主要仪器

电子分析天平(瑞士Mettler公司)； 低温高速离心机(日本日立公司)；烤片机(中国天津爱华公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；电子恒温水浴锅(上海森信仪器公司)。

1.3 主要试剂

多聚甲醛(北京化学试剂厂)；羧甲基纤维素钠(天津市凯通化学试剂有限公司)；一抗(北京博奥森生物技术有限公司)；二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色剂(北京中杉生物工程技术有限公司)；TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche)。

1.4 药物

1.4.1 柯萨奇病毒B3(CVB3)Nancy标准株

由哈尔滨医科大学病原微生物实验室提供。在 Hela 细胞上传代，反复冻融 3次，并测得半数组织感染率(TCID50) 为10-7，-70℃低温冰箱保存备用。

1.4.2 苏木乙酸乙酯提取物

苏木，产地云南，购自黑龙江省药材公司，经生药鉴定符合《中国药典》标准。将苏木原材置于75%乙醇溶液浸泡4 h,加热至85℃，回流提取2 h，过滤提取液；重复上述流程2次，混匀滤液，置入旋转蒸发皿中，内浴蒸干后真空干燥箱烘干，干燥后打碎成粉，即苏木乙醇提取干粉。将苏木乙醇提取干粉置入双蒸水内混悬后，用乙酸乙酯反复萃取，再放入真空干燥箱干燥，粉碎机打碎，得到苏木乙酸乙酯提取物。将苏木乙酸乙酯提取物溶于5%羧甲基纤维素钠溶液中，制备成浓度为1030 mg/kg(82.4 mg/ml)的苏木乙酸乙酯溶液。

2 实验方法

2.1 动物分组

将50只雄性Balb/c小鼠随机分为3组：空白对照组(空白组)10只，苏木乙酸乙酯提取物组(苏木组)20只，模型对照组(模型组)20只。

2.2 模型建立及给药方法

将Balb/C 小鼠50只，自由饮水进食，饲养于动物实验室内进行造模；将小鼠用手固定，腹部朝上，头部略低于尾部，腹壁常规碘酒、酒精消毒后，右手持注射器将针头在下腹部腹白线稍向左的位置，从下腹部朝头方向几乎平行地刺入皮肤，针头到达皮下后，再向前进针3～5 cm，针尖能自由活动则说明刺到皮下。再把针竖起，使注射器与皮肤呈 45℃角斜刺入腹肌，进入腹腔内。针尖穿过腹肌进入腹腔后抵抗感消失。固定针头，回抽针栓，如无回血或尿液，以一定的速度慢慢注射药液。模型组、苏木组小鼠注射1×TCID50为10-7/ml CVB3Nancy 标准株病毒液 0.3 ml，空白组小鼠注射RM 1640稀释液0.3 ml。注射后观察小鼠有无腹部痉挛等异常症状。

小鼠接种病毒后半小时开始分别给药：空白组和模型组灌服2%羧甲基纤维素钠溶液0.2 ml，苏木组灌服苏木乙酸乙酯提取物0.2 ml，每日1次，连续给药14天。

2.3 标本采集

连续给药14天后，小鼠处死，用高温灭菌手术剪子打开小鼠胸腔取出心脏。沿左室长轴将心脏剪开于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后切片，HE染色观察心肌病理变化、TUNEL法检测心肌细胞凋亡及免疫组化法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达。

2.4 检测指标

2.4.1 HE染色观察心肌组织病理形态

二甲苯脱蜡；梯度乙醇水化；水冲洗；水化后的切片浸入苏木精染液中染色；1%盐酸乙醇溶液分化；弱碱性水溶液显蓝；0.5%伊红染色；梯度乙醇逐级脱水；中性树胶封片。

2.4.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

心肌组织常规石蜡包埋、切片、TUNEL法染色，检测凋亡心肌细胞。参照TUNEL试剂盒说明书操作。

结果判定：切片中心肌细胞细胞核内呈现棕黄色颗粒者为阳性细胞，细胞核内呈现蓝色颗粒者为阴性细胞。在400高倍视野下，每张切片计数5个高倍视野，分别计算每个视野细胞核数及凋亡阳性细胞核数，取均值，计算凋亡指数(AI)。

AI(%)=凋亡阳性的细胞核数/总计数的细胞核×100%

2.4.3 免疫组化法检测心肌细胞Bcl-2、Bax的蛋白表达

二甲苯溶液中脱蜡；梯度酒精脱蜡；用新鲜配制3%过氧化氢孵育室温；进行热修复抗原；加入一抗(兔抗Bcl-2兔多克隆抗体)；加入二抗(兔抗Bax兔多克隆抗体)；DAB显色；苏木素复染、脱水、透明、封片。置显微镜下观察。结果判定：切片心肌细胞出现棕黄色颗粒为阳性细胞。采用Rekzalla半定量分析法计算Bcl-2、Bax蛋白表达。

2.5 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。各项数据均以均数±标准差表示，两两比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 心肌组织的病理形态

光镜下显示：空白组小鼠心肌组织胞浆丰富而红染,胞核卵圆形,位于细胞中央，横纹清晰，间质少量血管及结缔组织。

模型组：心肌细胞局灶性水肿，胞浆疏松、淡染、横纹不清。有小灶性心肌细胞变性、坏死、血管充血，局部有炎细胞浸润。

与模型组比较，苏木组心肌损伤程度减轻，具有显著差异。表现为少数心肌细胞水肿、血管充血、极少或无心肌细胞变性、坏死，局部有少量炎细胞浸润。如图1所示。

图1 各组小鼠心肌组织的病理形态

3.2 小鼠心肌细胞凋亡变化

结果显示：空白组见少量凋亡的心肌细胞；与空白组比较，模型组、苏木组小鼠心肌细胞凋亡指数增加，有显著差异(P<0.05)；与模型组相比较，苏木组心肌组织中细胞凋亡指数明显减少，具有显著差异(P<0.05)(见表1)。凋亡的细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈淡蓝色。凋亡的心肌细胞多出现在炎症灶周围，还见到浸润的淋巴细胞凋亡。如图2所示。

图2 各组小鼠心肌细胞凋亡变化

组别n观察视野数凋亡细胞指数空白组1051．13±2．65模型组20517．60±4．73▲苏木组2057．54±2．16▲△

注：与空白组比较，▲P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3.3 小鼠心肌组织Bcl-2和Bax的蛋白表达

小鼠心肌组织中，Bcl-2蛋白阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于胞浆、胞核及核膜上，阳性染色细胞多分布于炎症周围的心肌细胞、少数浸润细胞及血管内皮细胞，呈灶状或散在分布，坏死的心肌细胞不表达。如图3所示。

图3 各组小鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达

Bax蛋白阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于胞浆内，阳性染色细胞多分布于炎症周围的心肌细胞、少数浸润细胞及血管平滑肌细胞。如图4所示。

图4 各组小鼠心肌组织Bax蛋白表达

结果显示，Bcl-2蛋白在空白组呈高表达(+++)，模型组中呈低表达(-～+)，苏木组较模型组明显增强，呈中表达(+～++)。Bax蛋白在空白组呈低表达(-～+)，模型组中呈高表达(+++)，苏木组较模型组明显减弱，呈中表达(+～++)。

4 讨论

研究发现[7]，在VMC急性期，随着病毒的大量复制，T细胞作为主要的炎性浸润细胞被激活，变为细胞毒性T淋巴细胞(CTL ) ，CTL被激活后胞浆颗粒被释放，穿孔素可插入靶细胞的胞浆膜，聚合形成聚合物，在靶细胞膜上形成不同孔径的跨膜通道，颗粒酶等其他效应分子可通过跨膜孔道进入靶细胞，激活内切酶系统，引起靶细胞凋亡。病毒诱导细胞凋亡还可能通过病毒自身基因的表达激活宿主细胞凋亡的相关基因，引起细胞凋亡。从本实验得出的结果来看，空白组小鼠心肌细胞见少量凋亡的细胞出现。与空白组小鼠比较，模型组、苏木组小鼠心肌组织的细胞凋亡指数均明显升高(P<0.05)，尤其模型组感染CVB3小鼠发生细胞凋亡的心肌细胞增多最明显，说明机体在感染CVB3病毒时，通过细胞发生凋亡对心肌组织造成了病理损害，提示在急性病毒性心肌炎发病过程中，发生明显的心肌细胞凋亡的现象。苏木组与模型组比较，心肌细胞的凋亡指数明显降低(P<0.05)，提示苏木乙酸乙酯提取物能够抑制感染CVB3小鼠心肌组织中细胞的凋亡，减轻心肌病理损伤。由此推断其机制可能为：苏木乙酸乙酯提取物可能通过抑制T细胞的活化和增殖来实现其免疫抑制作用，从而抑制病毒感染后细胞凋亡的发生。

细胞凋亡还受凋亡相关癌基因调控，其中Bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因。Bcl-2家族包含抑制和促进细胞凋亡两类功能相反的蛋白质,主要为Bcl-2蛋白和Bax蛋白[8]。Bcl-2和Bax占的优势比例决定了细胞在受到凋亡信号(如病毒)刺激后是否发生凋亡。 Bcl-2表达占优势时，形成同源二聚体，抑制细胞凋亡； Bax表达占优势时，形成异源二聚体，不仅可以拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，还可以形成Bax同源二聚体，导致的细胞凋亡。若抑制Bax基因表达，上调 Bcl-2/Bax的比值，能够抑制细胞的凋亡，促进细胞的存活。若Bax的表达过量则可抑制Bcl-2的功能而促进细胞的凋亡。本实验研究结果显示：在空白组心肌细胞Bcl-2蛋白呈高表达，Bax蛋白呈低表达；与空白组相比较，模型组Bcl-2蛋白表达明显减弱，呈低表达，Bax蛋白表达明显增强，呈高表达，细胞凋亡指数显著升高；与模型组相比较，苏木组Bcl-2蛋白表达增强， Bax蛋白表达减弱，细胞凋亡指数明显升高。实验表明，感染CVB3小鼠的心肌细胞凋亡中Bcl-2、Bax表达的优势变化起着主要作用，而苏木乙酸乙酯提取物可以改变心肌细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的主导优势，上调Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，从而抑制感染CVB3导致的心肌细胞凋亡。由此推断苏木乙酸乙酯提取物抑制感染CVB3小鼠心肌细胞凋亡的作用机制可能为：上调Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，起到抗细胞凋亡的作用。至于苏木乙酸乙酯提取物作用于诱导细胞凋亡的具体信号途径有待于进一步深入的研究。

[1] 王仑,宋晓东.病毒性心肌炎心肌细胞凋亡机制研究[J].中国分子心脏病学杂志，2001,3(5):264-268.

[2] 刘志平，张晶，陈会君.苏木乙酸乙酯提取物对慢性病毒性心肌炎模型小鼠T细胞亚群的影响[J].中医药信息,2015,32(2):22-24.

[3] 郭春风,周亚滨,陈会君.病毒性心肌炎的中医辨证施治[J].中医药信息,2014,31(6):109-101.

[4] 杨建飞，张婧懿.苏木乙酸乙酯提取物对大鼠慢性排斥移植心脏心肌生长因子含量的影响[J].中医药学报，2016,44(4):14-17.

[5] 杨颖，姚凤祯，于亚娟，等.病毒性心肌炎的中医药治疗研究进展[J].中医药学报，2014,42(4):126-127.

[6] 王彤,刘存志,刘玉珍,等.Bcl-2/Bax基因调控机体细胞凋亡的机制研究进展[J].中国老年学杂志,2008,28(8):1658-1660.

[7] 宋晓东,刘哲,辛颖,等.针对病毒性心肌炎的细胞凋亡研究[J].中国现代医学杂志，2006,16(23):2549-2552.

[8] 韩波,马沛然,韩秀珍,等.Bc1-2和Bax基因产物在小鼠柯萨奇病毒性心肌炎心肌组织中的表达[J].实用儿科临床杂志,2003,18(7):513-515.

国家自然科学基金项目(No.81102590)；黑龙江省高等学校青年学术骨干支持计划(No.1253G054)

翟文姬(1985-),女，黑龙江中医药大学2014级中医内科学专业博士研究生。

陈会君*(1978-),女，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：中医药治疗心血管疾病的临床和机制研究。

2016-08-24

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0001-04

修回日期：2016-09-10

中 药 研 究