高通量测序技术在妇产与遗传学科方面的应用

刘思平 贾蓓 肖忠坤 宋兰林

高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称“下一代测序”(next-generation sequencing technology,NGS)技术，能一次并行对几十到几百万条DNA分子进行序列测定。NGS技术发展迅猛，使得测序成本快速下降，同时具有全面、快速和准确等优点，因此，它在临床上迅速得到广泛应用。在妇产与遗传学科中，高通量测序不仅优于传统的产前筛查手段而获得快速推广，而且在自然流产、不孕不育甚至妇科肿瘤的检测方面发挥着日益重要的作用。

一、产前遗传筛查与产前诊断

染色体非整倍体会造成流产或新生儿智力低下、生长发育迟缓等临床症状，主要包括21三体综合征(T21)、18三体综合征(T18)和13三体综合征(T13)。产前遗传筛查是预防三体患儿出生的重要手段。传统产前筛查仅约80%总检出率和5%的假阳性。无创产前基因检测(non-invasive prenatal testing， NIPT)是伴随NGS技术的发展而在临床上广泛应用的新技术。该技术利用大规模平行测序测定孕妇外周血中游离的胎儿DNA片段，经过生物信息学分析来判断每条染色体的所占比例是否偏离正常参考区间，以此来准确判定胎儿染色体非整倍体的情况，具有无创、安全、快速和准确等特点。

Gil等[1]采用Meta分析，结果显示NIPT的T21、T18和T13检出率分别为96.3%、0.13%和91.0%，假阳性率分别为0.13%、90.3%和0.23%。Chitty等[2]对698 500例孕妇进行T21分析，结果显示NIPT较传统遗传筛查可减少3 368例高风险孕妇(≥1/150)的侵入性诊断，避免17例因侵入性诊断导致的流产。除了针对T21、T18、T13的筛查外，NIPT已经在其他染色体数目异常、染色体微缺失/微重复综合征及单基因病检测方面表现出巨大潜力。今年7月，美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)发表声明：对于大多数女性，NIPT可以取代传统T21、T18和T13筛查，而且还可以用来筛查性染色体非整倍体和某些染色体拷贝数变异[3]。

染色体微缺失/微重复是除染色体非整倍体外的另一大类新生儿出生缺陷疾病。此类患儿多数能正常存活，但出生后表现出不同程度的身体和智力异常。目前，该类疾病已发现近300种，总发病率约1/600。常见的染色体微缺失/微重复有Cir du chat(猫叫)综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、Williams综合征、22q11微缺失综合征和DiGeorge综合征等。随着NGS技术的发展，染色体微缺失/微重复综合征的产前遗传筛查将成为NIPT的下一个临床应用热点。Wapner等[4]对22q11.2缺失的检出率为97.8%，猫叫综合征(5p缺失)检出率为100%。Helgeson等[5]对175 393例孕妇进行染色体微缺失筛查，检出32例DiGeorge综合征，20例1p36、15q和5p缺失综合征，总假阳性率为0.0017%。Srinivasan等[6]检出的染色体微缺失/微重复的最小分别率为300kb。国际产前诊断协会(International Society of Pregnatal Diagnosis，ISPD)于去年8月明确指出NIPT可用于已知的染色体微缺失/微重复综合征的检测[7]。

二、流产查因

自然流产是妇科的一种常见疾病，多发生于怀孕早期，其发生率占全部妊娠的10%～15%，50%以上的自然流产与胚胎染色体异常有关。美国妇产科协会(American Congress of Obstetricans and Gynecologists，ACOG)、美国生殖医学学会(American Society of Reproductive Medicine，ASRM)和英国皇家妇产科协会(Royal College of Obsterricans and Gynecologists，RCOG)一致倡导要查明流产原因。流产病因的明确诊断，有利于对该类患者进行合理的治疗和遗传咨询，并能缓解孕妇心理负担，同时为下一胎的生育提供医学指导。

流产组织传统核型分析可确定染色体的数目异常及>5Mb的结构异常，准确度高且覆盖全面，是目前染色体疾病诊断的金标准。但该方法操作繁琐，具相对较高的组织培养失败率(10%～40%)[8]，存在漏诊、误诊等情况。NGS不仅可以一次性检测全部染色体的数目，而且可检测<5Mb结构异常，覆盖度更高，更均匀，更精确。Qi等[9]通过NGS检测到的染色体微缺失/微重复分辨率可达0.1Mb，远远优于传统核型分析；传统核型分析平均耗时22天，而NGS分析需7～10天，大大缩短检测时间；NGS检测无需细胞培养，且可检测冷冻样本，放宽了样本要求，可作为细胞培养失败核型分析的重要补救方法。

三、体外辅助生殖

我国不育不孕发病率逐年增长，体外受精和胚胎移植技术(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)为无法自然受孕的夫妇带来希望。然而，胚胎染色体非整倍体是影响IVF-ET成功的重要因素，主要因为体外受精获得的胚胎通常存在染色体非整倍体，且随着孕妇年龄越大，风险越高，当孕妇年龄达40岁时，胚胎染色体非整倍体超过50%。

健康的胚胎是IVF-ET成功的第一步，然而，基于形态学的胚胎选择不能筛查染色体非整倍性，所以植入前遗传学筛查/诊断(preimplantation genetic screening/diagnosis,PGS/PGD)越来越受到重视。PGS是指在试管婴儿助孕过程中，胚胎移植前对早期胚胎的遗传物质进行染色体数目和结构异常的分析，以期筛选出染色体正常的胚胎进行移植，从而提高妊娠率、降低流产率；PGD主要用于胚胎移植前遗传缺陷诊断，可有效降低遗传病患儿出生率，对临床体外辅助生殖意义重大。临床试验数据显示，PGS可使接受体外辅助生殖治疗的反复流产患者的流产率从33.5%降低到6.9%[10]，同时将临床妊娠率从45.8%提高至70.9%[11]。Yan等[12]利用PGD对移植胚胎进行突变位点、染色体异常以及连锁分析，成功地帮助遗传性多发性骨软骨瘤患者产下健康后代。

PGS/PGD最早采用单细胞荧光原位杂交技术(FISH)和聚合酶链式反应技术(PCR)，只能分析5～10对染色体，所得遗传信息有限。近几年兴起的比较基因组杂交(CGH)和单核苷酸多态性(SNP)基因芯片技术，已经能对细胞内所有染色体数目及结构进行全面、快速分析，但仅能检测已知信息，且成本高；而NGS技术可低成本、快速的对胚胎完成全面的遗传诊断。Gillssen等[13]比较了芯片技术和NGS技术在儿童严重智力障碍病因诊断中的作用，结果显示芯片的诊断率为12%，全外显子测序的诊断率为27%，全基因组测序的累计诊断率高达62%，体现出NGS技术较芯片技术在发现新信息方面的优势。

四、妇科肿瘤

女性常见恶性肿瘤主要有乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等，它们严重影响女性生殖健康。美国癌症协会统计数据预测，2016年美国将有246 660例乳腺癌新发病例，占女性新发病例29%，位列之首，60 050例子宫癌新发病例，占女性新发病例7%；40 450例乳腺癌患者死亡，位列女性癌症死亡人数第二，14 240例卵巢癌患者死亡，占女性癌症死亡人数的5%[14]。中国的情况也不容乐观，其中乳腺癌每年新发病例和死亡病例分别占全世界的 12.2% 和 9.6%[15]。

目前，临床上多采用影像学(CT和核磁共振等)以及血清学(肿瘤标志物)进行肿瘤筛查。影像学检测敏感度低，只能检测到一定大小的肿瘤。血清学检测敏感度及特异性较差，且早期肿瘤在血清学检测结果上无明显变化。肿瘤诊断的金标准是组织病理学，但需要组织样本，不仅有创而且很多患者无法取样。基于NGS技术的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)和循环肿瘤细胞(circulating Tumor Cell， CTC)使得肿瘤诊治进入液体活检时代。ctDNA是指肿瘤细胞DNA脱落或者细胞凋亡后释放进入到循环系统的遗传物质，CTC是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。ctDNA和CTC均携带实体瘤细胞的基因改变等信息，通过二者的检测可以对肿瘤患者进行精准的遗传信息解读，在无创肿瘤早期筛查、辅助诊断分型、个性化用药指导、预后判断和无创肿瘤动态监测等方面发挥日益重要的作用。

Schiavon等[16]利用ctDNA检测转移乳腺癌的灵敏度和特异性分别为75%和100%。明确三阴乳腺癌分子亚型可为基因靶向治疗提供重要依据，例如，基底样三阴乳腺癌患者的TP53基因突变频率(62%～80%)高于非基底样三阴乳腺癌患者(43%)，LAR亚型三阴乳腺癌患者的PIK3CA基因突变频率(46.2%)高于其他亚型患者(4.5%)[17]。Dawson等[18]结果显示ctDNA能实时监控转移乳腺癌患者接受治疗过程中PIK3CA、ZFYVE21、CD1A、IQCA1、MET和KIAA0406基因突变的动态变化。乳腺癌和宫颈癌患者经药物及手术治疗后，ctDNA检测到肿瘤复发较CT影像学分别提前13.5个月和7个月，对肿瘤复发的早期诊断、治疗、病情监测及预后评价具有重要意义[19-20]。通过监测外周血中衡量CTC的类型和数量，同样在妇科肿瘤治疗中发挥重要作用。Agelaki等[21]研究显示拉帕替尼治疗后的HER2阳性CTC数量有效减少，且疾病稳定患者较疾病进展患者更易出现CTC数量减少，这一结果证明了治疗期间监测CTC分子改变的可行性。Janni等[22]对3 173位早期乳腺癌患者进行Meta分析，结果显示CTC可以作为无疾病生存率、无远处转移生存率、乳腺癌特异生存率和总生存率的独立预后因素；Giuliano等[23]结果显示CTC数量可预测转移乳腺癌的转移潜力，即≥5 CTCs/7.5 mL的患者较<5 CTCs/7.5 mL患者不仅具有更多的转移灶而且会快速形成新的转移病变。

ctDNA和CTC能够准确反应恶性肿瘤的分子生物学特征，且可以直接从患者的外周血中获取，具有取样方便、无创等优点，便于连续检测和随访追踪,实现个性化治疗。因此，ctDNA和CTC有望发展成为一种新型的肿瘤学监测指标。

五、展望

随着测序技术的不断进步和测序成本的降低，NGS技术已在妇产与遗传学科领域包括产前遗传筛查与产前诊断、流产查因、体外辅助生殖和妇科肿瘤等发挥越来越重要的作用。NIPT筛查具有高灵敏度、高特异度和无创便捷等特点，现已广泛应用于胎儿产前基因筛查。鉴于NGS技术的飞速发展、染色体非整倍体的成功应用，同时人们对染色体微缺失/微重复和单基因病危害性的重视，染色体微缺失/微重复和单基因病的筛查必将成为NIPT临床转化的热点；自然流产和不孕不育比例逐年增加，利用NGS技术可精确排查染色体变异原因，提高治疗效率；基于NGS技术的PGS/PGD将大大提高移植率、妊娠率，降低流产率，为不孕不育家庭带来福音；作为一种灵敏、特异、无创的分子生物学检测手段，ctDNA和CTC检测将为妇科肿瘤早期筛查、分型诊断、复发监测和个体化治疗等提供有力的临床证据。

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