肥胖症患者脂肪组织中的SIRT1 mRNA和蛋白表达水平及临床意义

李莉，赵艳丽，刘传亮，于汪营

肥胖症患者脂肪组织中的SIRT1 mRNA和蛋白表达水平及临床意义

李莉1，赵艳丽2，刘传亮3，于汪营4

目的探讨肥胖症患者脂肪组织中的沉默信息调节因子1（SIRT1）mRNA和蛋白表达水平及其在肥胖症治疗中的临床意义。方法选取接受肥胖治疗的患者105例，以体质量指数（BMI）分为肥胖症组（BMI≥23 kg/m2）和对照组（18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2）；取2组患者腹膜脂肪组织。采用实时荧光定量PCR法检测2组患者脂肪组织SIRT1 mRNA表达水平；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脂肪组织SIRT1的蛋白表达水平。并分析2组SIRT1蛋白表达水平与BMI、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）以及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的相关性。结果肥胖症组SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组（P＜0.05）。肥胖症组脂肪组织中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于对照组（P＜0.05）。SIRT1的蛋白表达水平与总TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈负相关（r分别为-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。结论肥胖症患者腹膜脂肪组织中SIRT1 mRNA和蛋白表达水平较非肥胖患者均明显下降，且SIRT1蛋白表达水平与肥胖相关指标呈相关性，对临床治疗肥胖症具有一定的指导作用。

肥胖症；皮下脂肪，腹部；人体质量指数；RNA,信使；血脂异常；血糖；沉默信息调节因子1

肥胖是高血压、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等疾病的重要发病基础，肥胖症及其相关疾病严重损害了患者的身体和心理健康，使患者生活质量明显下降，已经成为严重的公共卫生问题［1-2］。现代医学认为，肥胖症的发生是一个复杂的慢性过程，通常是摄入热量过多而消耗太少，低能量代谢导致脂肪在体内堆积所致。目前，针对肥胖的分子水平研究主要集中在葡萄糖利用、脂肪储存和代谢、胰岛素信号通路等环节［3-4］。其中，沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在肥胖、胰岛素抵抗中的作用日益受到关注［5-6］。哺乳动物脂肪细胞中，SIRT1可能是通过胰岛素（INS）/胰岛素样生长因子（IGF）-1通路发挥作用，SIRT1影响INS/IGF-1信号通路下游的FOXO1（Forkhead box O1），通过调节FOXO1或FOXO1的靶基因来调控脂肪细胞分化［7］。目前，有关SIRT1在肥胖者脂肪组织中的表达情况尚少见报道。本研究旨在分析肥胖症患者脂肪组织中的SIRT1 mRNA和蛋白表达水平，探讨其在肥胖症治疗中的指导意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2012年4月—2014年4月来我院接受肥胖治疗的患者105例。纳入标准：（1）年龄＞18岁，没有遗传性疾病家族史。（2）无恶性肿瘤。（3）无糖尿病［根据病史及空腹血糖（FPG）］及甲状腺功能异常。（4）无肝肾功能不全。（5）无严重消化系统疾病影响进食或慢性腹泻。（6）无厌食症或近期未进行节食减肥。参照文献［8］，以体质量指数（BMI）作为分组的标准：BMI≥23 kg/m2者48例为肥胖症组，男19例，女29例，年龄36～69岁，平均（47.25±5.36）岁；18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2者57例为对照组，男23例，女34例，年龄35～69岁，平均（48.65±5.71）岁。2组性别（χ2=0.014）、年龄（t=0.198）差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要材料与试剂逆转录试剂盒和实时荧光定量2× SYBR Green Mix购自南京唯赞生物有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；SIRT1试剂盒、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自美国R&D公司；SIRT1小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；DAB显色剂购自上海生工生物有限公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；酶标仪MK3购自上海赛默飞世尔公司。

1.3 标本采集肥胖症组通过抽吸方法获取腹部皮下脂肪组织标本。对照组在腹部手术时，摘取切除组织的脂肪组织作为研究标本。所有试验者标本的收集均通过本院伦理委员会的批准及患者的知情同意。

1.4 检测方法

1.4.1 实时荧光定量PCR检测脂肪组织SIRT1 mRNA表达水平取2组患者脂肪组织0.1 g，根据RNA提取液试剂盒说明书进行总RNA提取，并逆转录为cDNA。根据GenBank提供的SIRT1的序列，设计引物如下：上游5′-GGGGTTTCTGTCTCCTGT-3′，下游5′-GAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；GAPDH：上游5′-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′。引物稀释为10 μmol/L。对引物特异性和退火温度进行条件优化后制备PCR反应体系，总反应体积20 μL。1 500 r/min离心1 min后将反应混合物离心至管底，反应条件：预变性94℃2 min；变性94℃30 s；退火60℃30 s；72℃延伸30 s，共35个循环。为确定产物的特异性，构建熔解曲线，实时荧光定量PCR仪上直接读取数据。

1.4.2ELISA检测脂肪组织SIRT1的蛋白表达水平取2组患者脂肪组织0.5 g，置于小烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块，加入200 μL组织裂解液，组织匀浆仪匀浆5 min，冰上放置20 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。根据ELISA试剂盒说明书检测SIRT1的蛋白表达水平，每个样本和标准品均设3个复孔，于酶标仪492 nm处测光密度（OD）值。

1.4.3 血清血脂、FPG以及空腹INS（FINS）水平检测分别抽取2组患者清晨空腹静脉血，4 000 r/min离心10 min后取上清，根据相关试剂盒说明书于Roche Modular PPI全自动生化分析仪上，CHOD-PAP法检测总胆固醇（TC）、GPO-PAP法检测三酰甘油（TG）、葡萄糖氧化酶法测定FPG、放射免疫法测定FINS。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=（FPG× FINS）/22.5。

1.5 统计学方法采用SPSS 15.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用表示，2组间比较用t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较用卡方检验。对照组和肥胖症组患者SIRT1蛋白表达水平与TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR的相关分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组脂肪组织中SIRT1实时荧光定量PCR检测结果显示，扩增曲线良好，重复性高。引物特异性好，扩增时未见杂峰出现，见图1。肥胖症组脂肪组织中SIRT1 mRNA表达水平（0.87±0.25）低于对照组（2.91±0.47），差异有统计学意义（t=2.196，P＜0.05）。

2.2 2组脂肪组织SIRT1的蛋白表达水平比较建立的ELISA标准曲线具有很好的线性，R2=0.992。肥胖症组脂肪组织中SIRT1蛋白表达水平低于对照组［（875.78±128.70）μg/L vs.（5 179.46±465.14）μg/L，t=4.505，P＜0.05］。

2.3 2组血清TC、TG及FPG等比较肥胖症组血清中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于对照组（P＜0.05），见表1。

2.4 对照组和肥胖症组患者SIRT1的蛋白表达水平与相关指标的相关分析结果SIRT1的蛋白表达水平与TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈负相关（r分别为-0.391、-0.941、-0.184、-0.215及-0.990，均P＜0.05）。

Fig.1Comparison of SIRT1 mRNA levels in adipose tissue between two groups图1 2组脂肪组织中SIRT1 mRNA表达水平比较

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2组血清血脂、血糖以及FINS水平比较

Tab.1Comparison of serum levels of lipids,fasting glucose and FINS between two groups表1 2组血清血脂、血糖以及FINS水平比较

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别肥胖症组对照组t n 48 57 TC（mmol/L）5.26±0.97 4.37±0.81 2.219＊TG（mmol/L）2.11±0.53 1.45±0.35 2.671＊FPG（mmol/L）10.83±2.81 5.13±1.47 3.058＊＊组别肥胖症组对照组t n 48 57 FINS（mU/L）16.37±3.37 9.61±2.85 2.971＊＊HOMA-IR 6.42±1.67 2.19±0.52 2.189＊

3 讨论

肥胖是一种与遗传、代谢密切相关的多因素疾病。目前，研究发现大多数肥胖患者存在不同程度的胰岛素抵抗［8-9］。胰岛素抵抗可促使正常人群糖耐受恶化，是导致2型糖尿病的主要原因［10］。

目前，有关SIRT1蛋白在肥胖患者脂肪组织中表达水平的研究较少。SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性Sirtuin去乙酰化家族中的一员，SIRT1在动物脂肪细胞分化与脂肪代谢过程中起着重要的调控作用。SIRT1的脱乙酰酶活性影响细胞的存活、分化、衰老和凋亡［11-12］。研究显示，在INS/IGF-1通路中，SIRT1可以作用于其上游胰岛素受体底物（IRS）-1，导致IRS-1磷酸化水平升高，此外，SIRT1还能够作用于通路下游FOXO1，上调FOXO1活性，增强其与CCAAT增强子结合蛋白α的相互作用，增加脂联素基因的转录水平，减轻胰岛素抵抗［13-15］。本研究结果显示，与对照组比较，肥胖症组脂肪组织SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均明显下降，提示SIRT1的下调可能导致胰岛素依赖的信号通路转导受阻，同时可能下调FOXO1活性，增加了胰岛素抵抗，这一表型与肥胖患者的临床表型是一致的。

肥胖患者多数伴有糖尿病、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病。本研究结果显示，肥胖症组脂肪组织中TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR均高于对照组，证实了肥胖患者的确存在血脂和血糖显著增高的情况。另外，SIRT1的蛋白表达水平与TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR呈负相关，提示SIRT1蛋白表达水平降低时，可能导致了患者糖代谢、脂代谢通路受阻，引起血糖、血脂以及HOMA-IR升高，导致病情加剧。这一结果在部分其他研究中也得到了初步证实［16］。

综上所述，SIRT1蛋白表达水平在肥胖患者中明显下调，其与肥胖患者血糖、血脂以及HOMA-IR呈负相关，可通过改善SIRT1蛋白表达水平达到调节代谢平衡、治疗肥胖的目的。

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（2016-05-24收稿2016-06-21修回）

（本文编辑陆荣展）

The expression levels and clinical significance of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients

LI Li1,ZHAO Yanli2,LIU Chuanliang3,YU Wangying4
1 Department of Endocrinology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City,Pingdingshan 467000,China; 2 Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou Universiti,Henan;3 General Surgery, 4 Department of Pathology,the Second People’s Hospital of Pingdingshan City

ObjectiveTo explore expression levels of SIRT1 mRNA and protein in adipose tissue of obese patients, and its clinical significance in the treatment of obesity.MethodsA total of 105 patients in our hospital were selected and divided into obesity group(BMI≥23 kg/m2)and control group(18.5 kg/m2≤BMI＜23 kg/m2)according to body mass index (BMI).SIRT1 mRNA expression levels in adipose tissue(collected from peritoneum)were detected by quantitative PCR method in two group.SIRT1 protein expression levels of adipose tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent (ELISA)in two groups.The relationships of SIRT1 expression,BMI,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),fasting plasma glucose(FPG)and insulin resistance(HOMA-IR)were analyzed between two group.ResultsSIRT1 mRNA and protein levels were significantly lower in obesity group than those of normal group(P＜0.05).The values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IRinadiposetissueweresignificantlyhigherinobesitygroupthanthoseofnormalgroup(P＜0.05).Theproteinexpression level of SIRT1 was positively correlated with values of TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IR(r=-0.391,-0.941,-0.184,0.215 and-0.990,P＜0.05).ConclusionSIRT1 mRNA and protein expression levels in adipose tissue are significantly reduced in obesity patients than those of control group.There is a close relationship between SIRT1 protein level and obesity index, which has certain guidance for clinical treatment of obesity.

obesity;subcutaneous fat,abdominal；body mass index；RNA,messenger；dyslipidemias；blood glucose；silent information regulator 1

R589.2

A

10.11958/20160404

1河南省平顶山市第二人民医院内分泌科（邮编467000）；2郑州大学第一附属医院内分泌科；3河南省平顶山市第二人民医院普外科，4病理科

李莉（1978），女，本科，主治医师，主要从事内分泌科临床研究