4种培养基对红曲霉M1莫纳可林K产量影响及基因差异表达分析

林 琳, 李贞景, 陈勉华, 高雅娟, 武慧佳, 王昌禄

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院/食品营养与安全教育部重点实验室， 天津 300457)

4种培养基对红曲霉M1莫纳可林K产量影响及基因差异表达分析

林 琳, 李贞景, 陈勉华, 高雅娟, 武慧佳, 王昌禄*

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院/食品营养与安全教育部重点实验室， 天津 300457)

莫纳可林K是红曲霉重要的次级代谢产物之一。研究了4种培养基质对红曲霉M1莫纳可林K产量的影响，并利用RT-qPCR的方法，对莫纳可林K相关基因簇mRNA水平的差异表达进行测定分析。结果表明，荞麦培养基中莫纳可林K的产量最高(8.49 mg/L)，其次为糙米(莫纳可林K产量7.12 mg/L)、燕麦(莫纳可林K产量4.77 mg/L)、大米(莫纳可林K产量2.11 mg/L)。荞麦培养基利于红曲霉莫纳可林K产生。基因差异表达研究发现，除MKB与MKC基因外，其他基因的表达量均与莫纳可林K产量呈正相关；不同培养基通过刺激红曲霉基因表达从而影响其次级代谢产物产生。

红曲霉; 莫纳可林K; 培养基; RT-qPCR

红曲霉(Monascussp.)，别名红曲、赤曲、红糟、红大米等，长期以来被认为是一种促进消化和血液循环的民间药物。李时珍认为红曲米 “味甜、性甘”，能促进“消化和血液循环”，并且能健脾、燥胃[1]。在中国，红曲霉的种类较为丰富，其生产发酵成本也较低，因而对于红曲霉的研究也越来越深入[2]。红曲霉中的红曲色素、γ-氨基丁酸、麦角甾醇和莫纳可林K等次级代谢产物具有抗炎、降血压、抗骨质疏松和降血脂等生理活性，因而越来越受到人们的重视[3-6]。

莫纳可林K(Monacolin K，MK)能竞争性抑制胆固醇合成限速酶(HMG-CoA还原酶)的活性，并能有效地刺激细胞表面低密度脂蛋白受体(LDL受体)形成，从而使体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度降低；相反，MK能促进高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的合成，减少高血压、冠心病的发病几率[7-8]。目前，MK已作为治疗高血脂、高胆固醇等疾病的临床药物[9]，研发含有MK的功能性食品更是受到推崇[10-12]，因此提高MK产量对于红曲霉功能性食品的开发具有重要意义。改变发酵条件提高MK产量是一种高效、便利，具有较强可行性的方法[13]。

红曲霉MK分子层面的相关研究起步较晚，Chen等[14]利用探针技术从丛毛红曲霉(M.pilosus)中筛选出MK相关基因簇MKA-MKI9个基因，开启了红曲霉MK基因水平的相关研究。关于发酵条件对红曲霉MK产量影响的分子机理研究较少，尤其通过不同培养基质对MK产量影响的分子水平研究更是鲜见报道。

本实验利用不同种类的培养基对红曲霉M1中MK产量的影响，同时结合RT-qPCR对不同培养基菌丝体MK相关基因簇表达量进行研究，从分子层面探求培养基对MK产量影响的原因，希望为MK相关基因簇的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种

红曲霉M1，由天津科技大学生物技术实验室保存。

1.1.2 实验原料

大麦芽、大米、糙米、燕麦、荞麦，均由辽宁巨龙有机食品有限公司购入；植物RNA提取试剂盒，OMEGA公司；HiFi- Script cDNA 第一链合成试剂盒，康为世纪生物科技有限公司；荧光定量Mix为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，Takara公司。

1.1.3 主要设备

1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；LRH- 250- GⅡ型培养箱，广东省医疗器械厂；KCL- 2000W型恒温恒湿培养箱，日本东京理化器械株氏会社；荧光定量PCR仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 菌种活化

活化培养基(麦芽汁培养基)：将一定量的大麦芽粉碎，加入4倍的水，55～60 ℃保温糖化3～4 h，滤去残渣，煮沸、过滤，加水稀释至糖度为12°Brix，加入3%琼脂，121 ℃灭菌20 min。

保藏菌种接种于斜面培养基，30 ℃恒温箱培养5～7 d，活化菌株。

1.3 液态种子培养

种子液培养基：葡萄糖 60 g/L，蛋白胨 20 g/L，NaNO310 g/L， MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L，水。分装至三角瓶中(100 mL培养液/250 mL 三角瓶)，121 ℃灭菌20 min。

将活化后的红曲霉菌挑入种子液培养基，摇床培养48 h，用纱布滤去菌丝体，得孢子悬浮液。

1.4 4种培养基质对MK产量的影响实验

选取大米、糙米、荞麦、燕麦作为培养基，用水浸泡过夜，沥干水分，每瓶装28 g湿米和12 mL水。121 ℃灭菌20 min。冷却至室温后，将孢子悬液以10%接种量分别接种于培养基上，发酵培养。30 ℃恒温培养10 d，之后转入25 ℃恒温恒湿培养箱继续培养，每组3个平行，从第10天开始，隔4天取样进行检测。

1.5 发酵产物中MK的检测

1.5.1 样品处理

在无菌操作台中使用无菌打孔器取样，50 ℃烘干，研磨成粉末，称取0.50 g，用10 mL 75%乙醇分3次进行萃取。每次超声30 min，3 500 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，待测。

1.5.2 MK标准品的制备及检测

配制质量浓度分别为5.00，10.00，50.00，100.00，200.00，400.00 mg/L的MK标准溶液。用高效液相色谱法(HPLC法)测定MK标准品，并绘制标准曲线。

1.5.3 MK检测条件

用HPLC进行检测，检测条件为：二极管阵列检测器，检测波长为237 nm；Agilent X DB- C18型色谱柱(5 m，4.6 mm×150 mm)，进样体积为20 μL，柱温为25 ℃，流速1 mL/min；流动相的乙腈与水之比为60∶40(在水相中加入0.1%的色谱甲酸)。

1.6 4种培养基菌丝体MK相关基因簇表达量测定

将MK产量最高时的4种培养基中红曲霉菌丝体剥落，每种培养基菌体称取100 mg，分别提取菌丝体RNA，反转录为cDNA，利用相对荧光定量PCR(RT-qPCR)对4种培养基中红曲霉菌丝体MK相关基因簇的表达量进行测定。RT-qPCR反应体系为：11 μL水，12 μL SYBR Ⅱ Mix，1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，总体系25 μL，每个样品做3个平行。以GenBank公布的红曲霉MK 相关基因簇MKA-MKI基因序列(GenBank accession No.DQ176595.1)以及内参基因β-actin(GenBank accession No.AJ417880.1)为参照，通过Primer 5设计引物，引物序列如表1。相对荧光定量PCR反应程序为95 ℃，30 s，1个循环；95 ℃，5 s，57 ℃，20 s，72 ℃，15 s，40个循环，熔解曲线分析(95 ℃，15 s,60℃，30 s,60～95 ℃，软件采集熔解峰)。

2 结果与分析

2.1 MK标准曲线

根据标准品浓度和相应的峰面积计算回归方程和相关系数，得到MK标准曲线的线性回归方程为y=63.48x，相关系数R2=0.996。

2.2 4种培养基质对MK产量的影响

按照1.4中的方法，研究不同培养基质对MK产量的影响，其结果如图1。

表1 RT-qPCR 所用引物

图1 4种培养基质对MK产量的影响Fig.1 Effects of four kinds of natural solid medium on MK production

功能性红曲的固态发酵时间较长，发酵周期一般为30 d，这与产MK的功能性红曲霉的生产特性有关[15]。由图1可知，在不同的培养基质中，MK的产量均呈现先增加后减少的趋势；不同培养基中MK产量达到峰值的时间不同，但产量最高值均在18～22 d出现。荞麦培养基中在MK产量最短时间内达到峰值，之后MK的含量迅速下降，Bizukojc等[16]认为MK含量突然下降是由于培养基pH值降低导致MK测定值减小。

培养基的组成对于微生物的生长和代谢有关键作用。不同培养基质对红曲霉产MK有显著影响。图1显示，4种发酵基质中MK的峰值浓度排序由高到低为：荞麦培养基中(MK质量浓度8.94 mg/L)、糙米培养基中(MK质量浓度7.12 mg/L )、燕麦培养基中(MK质量浓度4.77 mg/L)、大米培养基中(MK质量浓度2.11 mg/L)。以荞麦为培养基时， MK产量最高，约为大米培养基中的4倍。由此可知，培养基种类的不同对产物的含量影响显著，这与高红等[17]的实验结果相一致。荞麦培养基使红曲霉MK产量增加，可能是由于荞麦的营养成分丰富[7],且培养基颗粒松散，溶氧量高，刺激红曲霉中某些基因的表达，从而影响其次级代谢产物的产生[18]。图2为荞麦培养中红曲霉M1产MK的高效液相色谱图。其出峰时间为8.83 min，分离度及峰型良好。

图2 荞麦基质中红曲霉M1产MK的高效液相色谱Fig.2 HPLC analysis of Monacolin K in Monascus M1 fermented on buckwheat

2.3 4种培养基质红曲霉MK相关基因簇表达量差异

不同培养基红曲霉MK相关基因簇表达量差异，见图3。由图3可知，糙米、荞麦、燕麦培养基中的红曲霉MK基因簇中，除MKB与MKC基因外，其他基因的表达量均比大米组菌丝体的表达量高，这与图1中不同培养基对红曲霉MK产量影响的情况呈正相关。其中，荞麦培养基中的红曲霉MKF基因的表达量是大米培养基中的2.09倍，MKF基因对应编码转酯酶，二酮化合物在转脂酶的作用下，甲基丁酰CoA通过酯键连接到九酮化合物(Monacolin J)上，最终生成MK，这可能是导致荞麦培养基中MK产量高的一个原因。培养基通过刺激红曲霉MK相关基因簇的表达而影响红曲霉MK代谢产量。MK生物合成途径如图4[19](箭头右侧代表与该步骤反应相关酶的编码基因)。

图3 4种培养基红曲霉MK相关基因簇表达量差异Fig.3 Expression of Monacolin K biosysnsis genes in four kinds of natural solid medium

图4 MK生物合成途径Fig.4 Biosynthetic pathway of Monacolin K

3 结 论

研究了4种培养基质对红曲霉M1产MK的影响，结果表明，培养基种类的选择对MK的生成有显著影响，其中红曲霉M1在荞麦培养基上培养时，MK产量最高，质量浓度达到8.94 mg/L。其次为糙米培养基(MK产量7.12 mg/L)、燕麦培养基(MK产量4.77 mg/L)和大米培养基(MK产量2.11 mg/L)。在红曲霉的发酵生产中，大多数都是使用大米作为培养基，然而，该实验结果表明，荞麦培养基中MK产量约为大米培养基中的4倍。对于红曲霉MK的生产，荞麦作为培养基比大米更有优势。推测荞麦培养基使红曲霉MK产量增加，可能是由于荞麦的营养成分丰富，且培养基颗粒松散、溶氧量高，刺激红曲霉中某些基因的表达，从而影响其次级代谢产物的产生。

本实验通过RT-qPCR，从mRNA水平探求红曲霉MK相关基因簇表达量的变化，结合MK生物合成途径，从分子水平以及代谢途径推测MK产量增高的代谢机理。结果表明，除MKB与MKC基因外，红曲霉MK相关基因簇mRNA水平的基因表达量与MK产量呈正相关；不同培养基通过刺激红曲霉MK相关基因簇的表达从而影响MK产量；MKB与MKC基因的表达量与MK产量呈负相关。推测可能是由于MKB与MKC对应编码的二酮合成酶及P450单氧酶受到甲基丁酰CoA与九酮化合物(Monacolin J)的反馈抑制，而高浓度的甲基丁酰CoA与九酮化合物(Monacolin J)可以促进MKF表达，大量生成转酯酶，促进MK产生。MK合成相关基因簇中每个基因的具体功能仍需要通过基因敲除或过表达技术进一步深入研究。

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Effect of Four Kind of Medium on Monascus M1 with Monacolin K Production and Real-time Quantitative Analysis

LIN Lin, LI Zhenjing, CHEN Mianhua, GAO Yajuan WU Huijia, WANG Changlu*

(CollegeofFoodEngineeringandBiologicalTechnology/KeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,MinistryofEducation,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China)

Monacolin K is one of the important secondary metabolites ofMonascussp. The influence of Monacolin K production forMonascusM1 on four kinds of fermentation substrate were studied．And the mRNA expression of Monacolin K biosynthesis gene cluster was measured by RT-qPCR. The result showed that the concentration of Monacolin K was the highest(8.49 mg/L)cultured by buckwheat while the concentration of Monacolin K was 7.12, 4.77, 2.11 mg/L cultured by brown rice, oats, and rice. And there was positive correlation between the expression genes related to MK and the MK production, except forMKBandMKC. The different kinds of culture medium could influence the secondary metabolites production by stimulating the gene clusters.

Monascussp.; Monacolin K; culture medium; RT-qPCR

叶红波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.05.006

2095-6002(2016)05-0043-05

林琳,李贞景,陈勉华,等. 4种培养基对红曲霉M1莫纳可林K产量影响及基因差异表达分析[J]. 食品科学技术学报，2016,34(5):43-47. LIN Lin, LI Zhenjing, CHEN Mianhua, et al. Effect of four kind of medium onMonascusM1 with Monacolin K production and real-time quantitative analysis[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016,34(5):43-47.

2015-12-09

国家自然科学基金资助项目(31171729)。

林 琳，女，博士研究生，研究方向为食品科学；

*王昌禄，男，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术方面的研究。通信作者。

TS201.3; Q815

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