碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化

马艳芳, 李玉洋, 刘金龙, 郑明刚, 孙中涛，*

(1.山东农业大学 生命科学学院， 山东 泰安 271018；2.国家海洋局 海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室， 山东 青岛 266000)

碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化

马艳芳1, 李玉洋1, 刘金龙1, 郑明刚2, 孙中涛1，*

(1.山东农业大学 生命科学学院， 山东 泰安 271018；2.国家海洋局 海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室， 山东 青岛 266000)

为了提高螺旋藻肽的抗氧化能力与收率，采用单因素实验和响应面法对碱性蛋白酶水解螺旋藻粉制备抗氧化活性肽的工艺条件进行优化。实验结果表明，与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶相比，碱性蛋白酶对螺旋藻粉的水解能力最强，其最适水解条件为55.46 ℃、pH值为 6.71、固(g)液(mL)比为1∶10.83。在此条件下，酶解240 min，螺旋藻肽的收率为58.50%，与优化前相比，提高了15.61%。所制备的螺旋藻肽具有较强的抗氧化能力，在质量浓度为0.86 g/L时，其DPPH·清除能力为77.60%，与优化前相比，提高了7.62%。

螺旋藻； 碱性蛋白酶； 抗氧化活性肽； DPPH·清除能力

螺旋藻(SpirulinaplatensisGeitl)是一种由单细胞或者多细胞组成的丝状低等原核生物，藻胆蛋白含量高达50%～70%[1]，且氨基酸组成比例非常理想[2]，被联合国粮农组织认定为“人类21世纪最佳保健品”和“未来超级营养食品”[3-4]，但螺旋藻溶解性差、腥味浓重[5]的缺点使其在食品行业中的应用受到限制。

经蛋白酶适度水解后的螺旋藻粉，物化特性和生物效价改善的同时还提高了营养价值。与螺旋藻蛋白相比，其水解产物螺旋藻肽不仅具有较低的分子量和良好的物化特性，更容易被人体消化和吸收，而且还具有抗氧化能力，可消除并防止机体受到自由基的破坏等生理功能[6-8]。

目前，对螺旋藻肽生产工艺的优化多以提高水解度为目标，但这种单纯追求高水解度的生产方式是不科学的，其原因是水解度与抗氧化能力之间并不是单纯的线性关系[9]。本研究以螺旋藻粉为原料，采用单因素实验和响应面法来探究蛋白酶种类、水解温度、pH值、固液比、酶底比(E/S)及水解时间等生产条件[10]对螺旋藻水解过程的影响，以提高螺旋藻肽的抗氧化能力与收率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻粉购于山东省滨州市天健生物科技有限公司，蛋白质质量分数为59.875%。胰蛋白酶(2×105U/g)、碱性蛋白酶(2×105U/mL)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)和风味蛋白酶(2×105U/g)分别由济南亚康力诺生物工程有限公司、南宁东恒华道生物科技有限责任公司与南宁庞博生物工程有限公司提供。1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)由Sigma公司生产，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

电子天平，上海恒平科技仪器有限公司；pHS- 3C 型数字酸度计，上海雷磁仪器厂；恒温振荡器，太仓市实验设备厂；UV2800型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 水解度的测定

可用水解后生成的α-氨基态氮的量占总含氮量的百分比表示水解度(degree of hydrolysis, DH)的大小[11]。生成α-氨基态氮的量采用茚三酮法测定[12]，样品总含氮量则采用凯氏定氮法测定[13]，水解度按照式(1)计算。

水解度=(水解后生成的α-氨基态氮的量/

样品的总含氮量)×100%。

(1)

1.3.2 DPPH·清除能力的测定

采用Yamagucei等[14]的方法并稍有改动：将2 mL一定质量浓度 (0.5～2.5 g/L)的螺旋藻肽溶液与2 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液充分混匀后，室温放置30 min，于517 nm处测定吸光值。DPPH·清除能力的计算见式(2)。

(2)

式(2)中：A1为DPPH溶液与螺旋藻肽溶液测得的吸光值；A2为95%乙醇与螺旋藻肽溶液测得的吸光值；A3为DPPH溶液与蒸馏水测得的吸光值。

1.3.3 螺旋藻肽收率的测定

参考刘红梅等[15]的方法并稍有改动:将抽滤酶解液得到的滤饼于80 ℃烘至恒重，称重。螺旋藻肽的收率按照式(3)计算。

螺旋藻肽收率=

(3)

1.3.4 蛋白酶种类的选择

称取10 g螺旋藻粉置于装有100 mL去离子水的250 mL三角瓶中，混匀后于90 ℃保温10 min，待温度降到55～60 ℃后，调节其pH值，并加入蛋白酶进行水解。碱性蛋白酶的水解条件为pH值7.0、加酶量2.15%(E/S，以底物质量计)、水解温度55 ℃、水解时间240 min；木瓜蛋白酶的水解条件为pH值6.0、加酶量0.6%(E/S，以底物质量计)、水解温度60 ℃、水解时间210 min；胰蛋白酶的水解条件为pH值6.0、加酶量4%(E/S，以底物质量计)、水解温度55 ℃、水解时间180 min；风味蛋白酶的水解条件为pH值7.0、加酶量4%(E/S，以底物质量计)、水解温度为55 ℃、水解时间240 min。待水解完成后于沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温、抽滤，计算酶解液的水解度、DPPH自由基清除率及收率。

1.3.5 单因素实验

参考孙宜君等[16]、武萌萌等[17]酶解螺旋藻粉的实验并稍有改动，酶解的基本条件为：碱性蛋白酶的添加量为4 300 U/g 螺旋藻粉，固(g)液(mL)比为1∶10，酶解温度55 ℃，酶解时间240 min。选择温度、pH值、固液比及酶用量4个因素进行单因素实验。

1.3.6 响应面试验

在单因素实验的基础上，以温度、pH值、固液比3个因子为研究对象，DPPH·清除能力和收率为响应值，设计响应面试验，各因素与水平见表1。用Design Expert 8.0软件对实验数据进行多元回归分析并构建DPPH自由基清除能力和收率与3个因子的二次多项式数学模型，见式(4)。

(4)

式(4)中，Y为响应值(收率与DPP4·消除能力；xi，xj为自变量偏码值；αα为常系数；αi为线性系数；αii为二次项系数；αij为交互项系数。

表1 响应面试验因素和水平

2 结果与分析

2.1 水解用酶的确定

蛋白酶种类对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响如图1。碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶水解物的水解度、DPPH·清除能力与收率均高于胰蛋白酶和风味蛋白酶。虽然碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶水解物的水解度、DPPH·清除能力与收率相差不大，但碱性蛋白酶的成本低于木瓜蛋白酶。因此，本研究采用碱性蛋白酶对螺旋藻粉进行水解。

图1 蛋白酶种类对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响Fig.1 Effect of different proteases on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.2 温度的确定

酶解温度对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响见图2。温度较低时，螺旋藻肽的收率、水解度均随着温度的升高而增大，并在55 ℃时达到最大，当温度继续升高时，水解度及收率均明显下降，而DPPH·清除能力是随着温度的升高逐渐增大的，这与水解度的变化规律不同。水解度对螺旋藻肽的抗氧化能力有显著影响，但并不是水解度越高，其抗氧化能力越强。综合考虑温度对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率影响，本研究选择55 ℃为酶解反应的较适宜温度。

图2 温度对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响Fig.2 Effect of temperature on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.3 pH值的确定

图3 pH值对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响Fig.3 Effect of different pH on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

pH值对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响见图3。pH值较低时，水解度、DPPH·清除能力与收率均随pH值的增大而增大，并且在pH值为7.0时达到最大，随后再增加pH值，三者均明显下降。通常，碱性蛋白酶的最适作用pH值为8.0～9.0，这与本研究结果不同，原因是酶促反应的最适pH值受底物种类的影响，与碱性环境相比，藻胆蛋白在pH值为7.0时的溶解性更好，更有利于底物与酶接触，因此，pH值7.0为较佳酶解温度。

2.4 固液比的确定

固液比对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响如图4。固液比从1∶5减小到1∶10时，螺旋藻肽的DPPH·清除能力、收率与水解度均明显增大，随后再减小固液比，三者均明显下降。这主要是因为，在固液比较小时，底物质量分数较小，酶与底物接触的机会少，反应速率慢，导致了螺旋藻肽的水解度、抗氧化能力与收率较低。但当固液比太大时，蛋白之间发生交联聚合，溶解性变差，黏度增大，酶与底物分子之间接触的机会减少，水解速度降低，从而使得螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率降低。

图4 固液比对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响Fig.4 Effect of solid liquid ratio on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.5 酶用量的确定

酶用量对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响见图5。当蛋白酶量从1 300 U/g增加到4 300 U/g时，水解度、DPPH·清除能力与收率增加较快，此后，再增加酶用量，三者上升缓慢。其原因是当加酶量较少时，增大加酶量可以增加酶与底物接触的机会，从而加快水解速度，螺旋藻肽的水解度、DPPH·清除能力与收率迅速增大；但当加酶量较高时，酶用量不再是酶解反应的限制因素，并且，在实际生产过程中，加酶量过大会增大生产成本。因此，本研究选择4 300 U/g为最适加酶量。

图5 酶用量对螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力与收率的影响Fig.5 Effect of dosage of proteases on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.6 响应面试验结果

响应面试验结果见表2。采用Design Expert 8.0软件对所得实验数据进行回归分析，可得到式(5)、式(6)两个回归方程。

表2 响应面试验设计与结果

Y1=76.81+1.01X1-5.05X2+3.05X3-3.22X1X2+

(5)

Y2=58.31-0.49X1-0.88X2+2.79X3-3.08X1X2-

(6)

式(5)、(6)中，X1、X2、X3分别为自变量的编码；Y1为DPPH·清除能力，%；Y2为收率，%。

表3 二次回归方程的方差分析结果

*显著(p<0.05)，**极显著(p<0.01)

图6 温度和pH值对螺旋藻肽DPPH·清除能力与收率影响的响应面图Fig.6 Response surface analysis of influence of temperature and pH on DPPH· radical scavenging ability and yield

3 结 论

水解温度、pH值、固液比、蛋白酶种类、酶底比(E/S)以及水解时间等因素均对螺旋藻肽的抗氧化能力与收率有影响，其抗氧化能力与收率的提高可通过优化酶解过程的某些条件实现。以螺旋藻粉为原料，采用单因素实验法与响应面法对碱性蛋白酶水解螺旋藻生产螺旋藻肽的工艺条件进行优化，结果表明，与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶与风味蛋白酶相比，碱性蛋白酶对螺旋藻肽有较强的水解能力，其优化水解条件为55.46 ℃、pH值6.71、固液比为1∶10.83，在此条件下酶解240 min，螺旋藻肽的收率为58.50%；螺旋藻肽的质量分数为0.86 g/L时，其DPPH·清除能力为77.60%，与优化前相比，DPPH·清除能力与收率分别提高了7.62%和15.61%。水解度对螺旋藻肽的抗氧化能力有影响，但是水解度与抗氧化能力之间并不是单纯的线性关系，因此，在实际生产过程中，应合理地控制水解度，以提高产品的抗氧化能力与收率。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Antioxidative Peptides fromSpirulinaUsing Alcalase

MA Yanfang1, LI Yuyang1, LIU Jinlong1, ZHENG Minggang2, SUN Zhongtao1,*

(1.CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China;2.KeyLabofMarineBioactiveSubstanceandModernAnalyticalTechnique,Qingdao266000,China)

The hydrolysis conditions of antioxidant peptides fromSpirulinapowder using alcalase were optimized by single factor methods and the Box-Behnken experiments, in order to improve the antioxidant abilities and the yield ofSpirulinapeptides.The results showed that alcalase has the highest hydrolysis ability compared with other commercial proteases, incluing papain, trypsase and flavourzyme, and it’s optimum hydrolysis conditions were 55.46 ℃, pH 6.71 and the solid liquid ratio was 1∶10.83. When theSpirulinapowder were hydrolyzed for 240 min under the optimized conditions, the yield of theSpirulinapeptides was 58.50%, increasing by 15.61% compared with the control. The DPPH radical scavenging ability ofSpirulinapeptides reached 77.597%, at the mass fraction ofSpirulinapeptides was 0.86 g/L, increased by 7.62% compared with the control.

Spirulina; alcalase; antioxidant peptides; DPPH radical scavenging ability

叶红波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.05.004

2095-6002(2016)05-0026-07

马艳芳，李玉洋，刘金龙，等. 碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化[J]. 食品科学技术学报，2016,34(5):26-32. MA Yanfang,LI Yuyang,LIU Jinlong, et al. Optimization of hydrolysis conditions for antioxidative peptides fromSpirulinausing alcalase[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016,34(5):26-32.

2015-11-26

国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金资助项目(MBSMAT- 2014- 05)。

马艳芳，女，硕士研究生，研究方向为发酵工程与酶工程；

*孙中涛，男，副教授，博士，主要从事发酵工程与酶工程方面的研究。通信作者。

TS201.4； Q556

A