离子液体中胰岛素结构稳定性的分子动力学模拟

潘晓莉，李代禧，魏冬青



离子液体中胰岛素结构稳定性的分子动力学模拟

潘晓莉1，李代禧1，魏冬青2

（1上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093；2上海交通大学微生物代谢国家重点实验室，上海 200240）

离子液体作为一种新型绿色溶剂，由于其独特的物理化学性质，被广泛应用于蛋白质的稳定性研究。选用热敏性蛋白药物胰岛素作为研究对象，采用分子动力学模拟方法，从分子层面上研究不同种类的离子液体对胰岛素结构的稳定效果。结果表明，与纯水体系相比，在常温下离子液体能够有效地稳定胰岛素的分子结构，且体系中阴离子的氢键碱性越弱，阳离子的烷基链越短，对胰岛素分子结构的稳定作用越强。并深入分析不同烷基链长度的二氰胺类离子液体与胰岛素之间的相互作用，发现相较于长烷基链离子液体，短烷基链离子液体与胰岛素之间的相互作用更强，揭示了后者能更好地维持和稳定胰岛蛋白的分子结构。

离子液体；胰岛素；蛋白质稳定性；相互作用能；分子模拟

引 言

随着生物技术的发展，蛋白类药物已成为生物技术新药的主要类型，并逐步转为商业化生产。然而，蛋白质的不稳定性极大程度地限制了其医学以及商业应用[1-2]。由此，对热敏性蛋白药物稳定性的不断探索一直是生物制药领域的研究热点。胰岛素具有降低血糖的功能，是很多糖尿病患者的必备药物。同时，它也是一种非常典型的热敏性蛋白药物[3]。胰岛素常以六聚体的结构存在，作为缓释剂，但以单体结构发挥其生理功能。胰岛素单体在常温下极其不稳定，常因其结构变性而失去生物活性[4]。

与传统的有机溶剂相比，离子液体具有其独特的理化性质，如极低的熔点和蒸气压、高极性和热稳定性、可调的溶解能力等。作为一种新型“绿色溶剂”，离子液体已经被广泛应用于蛋白质的稳定性研究[5-6]。许多实验结果表明蛋白质在离子液体中具有良好的稳定性[7-12]。例如在[chol][dhp]（胆碱磷酸二氢盐）中，HAS（人血清蛋白）的三级折叠结构保持不变[10]；另有报道木瓜蛋白酶在[Emim][BF4]（1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐）中具有较高的催化活性[11]。此外，Yao等[12]考察二元离子液体对蛋白质的稳定性影响时，发现脂肪酶的活性结构在[C4mim][PF6]（1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸盐）- [C4mim][BF4]（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐）混合体系中得到较好的保持。因此，研究离子液体的性质与热敏性蛋白药物稳定性之间的关系，对离子液体的分子设计及蛋白质的稳定保护具有重要意义。

本文以胰岛素单体为研究对象，选择10种不同种类的离子液体作为溶剂，采用分子动力学模拟（molecular dynamic，MD）方法[13]，从分子层面上探讨离子液体氢键碱性的强弱及烷基链的长短与胰岛蛋白结构稳定性之间的差异性。以期突破实验研究的局限性，并与国际上提出的“绿色化学”接轨，对研究离子液体稳定热敏性蛋白药物具有一定的参考作用。

1 实验部分

1.1 结构的准备

本文选用了10种咪唑类离子液体： [C4mim][NO3]（1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐）、[C4mim][CH3SO3] （1-丁基-3-甲基咪唑甲基磺酸盐）、[C4mim][Cl] （1-丁基-3-甲基咪唑氯盐）、[C4mim][OAC]（1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐）和[Cmim] [DCA]（4, 6, 8, 10, 12, 14）（1-烷基-3-甲基咪唑二氰胺盐）。所有的离子液体初始分子结构（图1）均取自于Chemical数据库，并利用Gaussian09软件包在HF/6-31G* 方法下进行结构优化，得到最终的离子液体结构[14]。

图1 离子液体的分子结构

胰岛素的初始结构取自于PDB数据库（ID：3inc[15]），删除其他原子得到经二硫键共价键合的胰岛素单体，如图2所示。

图2 胰岛素的初始三维结构

1.2 模拟过程

分子动力学模拟方法采用Gromacs5.0.5[16]软件包，其中胰岛蛋白选用Amber99sb-ildn[17]分子力场，离子液体选用Amber[18]通用分子力场，水分子选用Tip4p[19]模型。本次模拟中，时间步长设定为2fs，范德华分子间相互作用和静电相互作用的截断均设为1.0nm，静电相互作用的远程修正采用PME（particle mesh Ewald）[20]方法。系统压力采用Berendsen[21]方法控制为1个标准大气压，并将velocity-rescal[22]方法用于温度的控制，模拟温度设为300K。

首先，建立一个10 nm×10 nm×10 nm的周期性体系，在每个体系中分别添加1个胰岛素单体分子、400个离子液体及相应的抗衡离子，共构建了10个不同种类的离子液体体系，各体系组成如表1所示。另外构建了胰岛素的纯水体系作为参考体系。每个体系均采用最速下降法[23]进行1 ns的结构优化，接着在NPT系综下进行10 ns的限制性分子动力学模拟，使离子液体或水分子在胰岛素周围均匀分布。然后在相同系综下对体系进行常规分子动力学模拟，所有体系的模拟时间长度为60 ns。取最后5 ns的模拟轨迹用于分析胰岛素的结构保护结果。

表1 不同种类离子液体体系的组成

2 结果和讨论

2.1 不同氢键碱性的离子液体对热敏性蛋白稳定性的影响

2.1.1 [C4mim]系列离子液体体系中胰岛素的整体构象变化分析 均方根偏差[24]（root mean square deviation，RMSD）可以反映特定构象与初始结构的相似程度，其值越低，表明特定构象与初始结构的差异性越小[25]。通过计算各体系中胰岛素的RMSD值（图3）表征不同氢键碱性的离子液体对热敏性蛋白构象的稳定性影响。由图3可知，相较于纯水体系，离子液体体系中胰岛素的RMSD值大幅度降低，且随着离子液体氢键碱性的减弱（[OAC]-＞[Cl]-＞[CH3SO3]-＞[NO3]-＞[DCA]-）[26]，RMSD值降低的幅度增加。这说明离子液体能有效稳定胰岛素的分子结构，且氢键碱性较弱的离子液体对胰岛蛋白表现出更优的稳定效果。而氢键碱性较强的离子液体对胰岛素呈现出较弱的稳定性，是因为离子液体的氢键碱性越强，越容易破坏维持蛋白质高级有序结构的作用力，导致蛋白质分子构象的稳定性降低[26-27]。

图3 各体系中胰岛素的RMSD值

2.1.2 [C4mim]系列离子液体体系中胰岛素的二级结构差异性分析 胰岛素的RMSD值体现蛋白质整体结构的变化，要得到离子液体氢键碱性的强弱对胰岛素局部结构的影响，还需对各体系中胰岛素的二级结构进行分析。因此，通过DSSP[28]（definition of secondary structure of proteins）软件统计了蛋白质二级结构的构象变化，结果如图4所示。从图中可以看出，与初始结构相比，纯水体系中胰岛素的α-螺旋数目大幅度减少，其无规则卷曲数目则大幅度增加；而在不同氢键碱性的离子液体中，胰岛素的二级结构并未大量转变为无规则卷曲，这表明相较于纯水体系，离子液体具有稳定蛋白质分子结构的作用。特别是在氢键碱性较弱的[C4mim][DCA]体系中，胰岛素的二级结构几乎和初始结构一致，说明该种离子液体对蛋白质的二级结构具有良好的保护效果。但随着离子液体氢键碱性的增强（[NO3]-＜[CH3SO3]-＜[Cl]-＜[OAC]-），胰岛素的α-螺旋数目呈减少趋势，β-转角数目随之增加。表明离子液体的氢键碱性影响胰岛蛋白二级结构的稳定性，氢键碱性越强，二级结构的稳定性越弱。

图4 各体系中胰岛素二级结构的变化

2.2 不同长度烷基链的离子液体对蛋白质的稳定性影响

2.2.1 [DCA]系列离子液体体系中胰岛素的结构差异性分析 离子液体对蛋白质的稳定性由阴、阳离子的理化性质共同决定。由2.1节可得，氢键碱性较弱的[C4mim][DCA]更能稳定热敏性蛋白药物的分子结构。因此，为了探讨离子液体的烷基链长度对蛋白质的稳定性影响，计算不同长度烷基链的[DCA]类离子液体体系中胰岛素的RMSD值（图5）。在[Cmim][DCA]（4～14）体系中，随着离子液体烷基链长度的增加（值增加），胰岛蛋白的RMSD值呈上升趋势，且当烷基链上的碳原子个数≥10时，该值上升的幅度变大。说明胰岛蛋白的稳定性与离子液体的烷基链长度密切相关，短烷基链咪唑类离子液体能有效稳定胰岛素的分子结构，当阳离子的烷基链较长时，离子液体对胰岛素的稳定效果明显减弱。

图5 各体系中胰岛素的RMSD值

Yan等[29]用荧光光谱法研究在一系列不同长度烷基链的离子液体中α-胰凝乳蛋白酶的活性和稳定性，得出该酶能稳定存活于[Cmim][Br]（4, 6, 8）（1-烷基-3-甲基咪唑溴盐）中，相反地，在[C10mim][Br]中该酶的催化活性较大程度地降低。娄文勇等[11]通过高效液相色谱法研究离子液体的组成对木瓜蛋白酶活性的影响时，发现在[Cmim][BF4]（2～6）（1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐）介质中，酶活性随着离子液体烷基链长度的缩短而提高。这些实验结果与本文通过分子动力学模拟方法研究得出胰岛素在短烷基链咪唑类离子液体中稳定性更优的结果一致，表明短烷基链离子液体确实更能稳定胰岛蛋白的分子结构。

为深入分析蛋白质在不同长度烷基链离子液体中的结构差异性，详细统计了不同烷基链长度的离子液体体系中胰岛素二级结构数目的变化，结果示于图6。从图中可以观察到，相较于初始结构，[Cmim][DCA] (4～ 8)体系中胰岛蛋白的二级结构均未发生较大变化；而在[Cmim][DCA]（10～14）体系中，随着离子液体烷基链长度的持续增加，蛋白质的α-螺旋数目呈降低趋势，其β-转角及无规则卷曲数目均随之小幅度升高。这说明短烷基链离子液体能够有效稳定胰岛蛋白的二级结构；相反地，长烷基链离子液体体系中蛋白质的二级结构发生了一定程度的变化，且随着烷基链长度的增加，变化越剧烈。

图6 各体系中胰岛素二级结构的变化

2.2.2 [DCA]系列离子液体体系中离子液体与胰岛素之间的相互作用分析 离子液体通过与胰岛素之间的相互作用发挥其稳定热敏性蛋白活性结构的功能。分别计算[DCA]系列离子液体体系中阴离子、阳离子与胰岛素之间的相互作用能[图7(a)]，表征不同烷基链长度的离子液体与蛋白质之间的相互作用强度。观察图7(a)可知，随着阳离子烷基链长度的持续缩短，阳离子、阴离子与胰岛蛋白之间的相互作用能均增大，且阳离子烷基链越长，对阴离子与胰岛素之间相互作用能的影响越大。图7(b)描述了不同长度烷基链离子液体体系中胰岛素表面与阳离子之间的径向分布函数，第一个峰的峰值表示二者之间最强的相互作用[30]。由()分析得出，随着体系中烷基链长度的持续增大，第一个峰的峰值呈降低的趋势，且当烷基链上的碳原子个数≥10时，该峰值降低幅度增大。这说明与长烷基链咪唑类离子液体相比，短烷基链咪唑类离子液体与胰岛素之间呈现出更强的相互作用。这些数据表明相较于长烷基链离子液体，短烷基链离子液体通过较强的相互作用吸附和覆盖在胰岛素的表面，有效稳定热敏性蛋白胰岛素的分子结构。这也验证了2.2.1节中胰岛蛋白结构稳定性的分析结果。

图7 各体系中阴、阳离子与胰岛素之间的相互作用

(a) total energy between cations, anions and insulin; (b) radial distribution function between canion and surface of insulin

为了进一步阐释离子液体的烷基链长度如何影响离子液体与胰岛素之间的相互作用，分别计算体系中阳离子的1-甲基咪唑基和烷基与胰岛素之间的相互作用能（表2）。分析表2可得，6个体系中1-甲基咪唑基与胰岛素之间的相互作用能均远大于烷基与胰岛素之间的。说明阳离子主要依靠其1-甲基咪唑基与胰岛素之间的相互作用稳定蛋白质的分子结构，这可能是由于阳离子的正电荷主要分布在其1-甲基咪唑基上。为此分别分析了阳离子中1-甲基咪唑基和烷基与胰岛素之间的非键相互作用，结果如表2所示。比较表中数据可得，阳离子的1-甲基咪唑基与胰岛素之间的静电相互作用大于范德华相互作用；相反地，阳离子的烷基与胰岛素之间的主要相互作用为范德华相互作用。这证实了之前得出的猜想，阳离子的正电荷分布在咪唑环靠近甲基的N原子上，从而使带一个正电荷的1-甲基咪唑基与胰岛素表面的负电势氨基酸形成较强的静电相互作用；而阳离子的烷基部分几乎呈电中性，通过较弱的范德华相互作用吸附在胰岛蛋白表面。

Note:total—total interaction energy;ele—electrostatic interaction energy;vdw—van der Waals interaction energy.

长烷基链[C14mim][DCA]体系中阳离子与胰岛蛋白表面的直接吸附作用（图8）表明，与胰岛蛋白表面有直接吸附作用的是阳离子的1-甲基咪唑基，其烷基部分并未全部吸附在蛋白质的表面。进一步揭示了离子液体的1-甲基咪唑基与胰岛素之间形成的静电吸引作用提供了一种约束作用，抑制了蛋白质的伸展变化，有利于其结构的稳定。

图8 [C14mim][DCA]体系中阳离子与胰岛素表面直接吸附作用示意图

(blue part represents surface of insulin; purple part represents stick model of cation; green circles represent adsorption between surface of insulin and cation)

2.2.3 [DCA]系列离子液体体系中胰岛素与离子液体之间的接触数 接触数是指分子间发生相互作用的原子接触个数，该参数被用来表征两分子之间相互作用的强弱[31]。因此，通过Gromacs中的mindist程序分别计算了胰岛素与阴离子和阳离子的1-甲基咪唑基之间的接触数[32]（如图9），表征胰岛素与阴、阳离子之间的相互作用强度。

观察图9可得，随着阳离子烷基链长度的增加，胰岛素与阴离子和阳离子的1-甲基咪唑基之间的接触数均呈降低趋势，说明胰岛素与阴、阳离子之间的相互作用强度均随着阳离子烷基链长度的增加而减弱。这是因为长烷基链阳离子的结构较大，使体系中阴、阳离子吸附在胰岛蛋白表面的概率均较小，二者之间的原子接触数也较少，导致阴、阳离子与胰岛素之间的相互作用能较低（见图7）。这揭示了离子液体的烷基链长度较大程度地影响其与蛋白质之间的相互作用强度，阳离子结构较小的短烷基链咪唑类离子液体与胰岛素之间具有较强的相互作用，进而显示出对热敏性蛋白药物更好的保护性。

图9 胰岛素与阴离子和阳离子的1-甲基咪唑基之间的接触数

3 结 论

本文利用分子动力学模拟方法，从分子水平上阐释了离子液体氢键碱性的强弱及烷基链的长短对热敏性蛋白药物胰岛素稳定性的影响。分析结果表明，离子液体，特别是氢键碱性较弱且烷基链较短的离子液体能有效稳定胰岛素的分子结构。离子液体的阳离子主要依靠其1-甲基咪唑基与胰岛素之间的静电相互作用稳定蛋白质的分子结构。且相较于长烷基链[DCA]离子液体，分子结构较小的短烷基链[DCA]离子液体与胰岛素之间的相互作用更强，进一步揭示了短烷基链咪唑类离子液体对蛋白质的稳定效果更优。

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Structural stability of insulin in imidazolium ionic liquids by molecular simulation

PAN Xiaoli1, LI Daixi1, WEI Dongqing2

(1Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Ionic liquids, as a kind of novel green solvents, have been widely applied to structural stability study of protein due to their unique physicochemical properties. In this study, insulin was chosen as a heat-sensitive protein medicine to research the structural stability of protein in various imidazolium ionic liquids from a molecular insight by using molecular dynamics simulation. The results indicate that the ionic liquids are able to stabilize the molecular structure of insulin effectively at room temperature compared with aqueous solution. The RMSD values and the secondary structure of insulin show that the weaker the hydrogen-bond basicity of anion is, the shorter the alkyl chain of cation is, the more stable the molecular structure of insulin is. In order to explain thoroughly the effect of alkyl chain length of ionic liquid on the stability of the protein, the interaction and the number of contact between the insulin and dicyanamide imidazolium ionic liquids with different alkyl chain length are further analyzed. It is found that the cation stabilize effectively the molecular structure of insulin which relies mainly on the electrostatic interaction between the insulin and the 1-methylimidazole of cation. Comparing to ionic liquids with long alkyl chain, the interaction between the insulin and ionic liquids is more powerful, and the insulin also adsorb more anion and 1-methylimidazole of cation in ionic liquids with short alkyl chain. All these results indicate that the ionic liquids with short chain alkyl indeed improve the molecular structural stability of insulin. Generally, the molecular dynamic simulation, as adopted to this research, provides a molecular insight to investigate the stability of insulin in ionic liquids, which is important and essential for molecular design of ionic liquids and stability study of heat-sensitive protein drugs.

ionic liquids; insulin; protein stability; interaction energy; molecular simulation

date: 2016-07-11.

Prof. LI Daixi,dxli75@126.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20160968

O 6-39

A

0438—1157（2016）12—5215—07

上海市重点学科项目（T0503，P0502）；上海市自然科学基金项目（12ZR1420400）；上海市“创新行动计划”国际科技合作项目（12430702000）；上海市联盟计划项目；上海理工大学人文社会科学基金项目（11XSY23）。

supported by the Shanghai Leading Academic Discipline Project (T0503, P0502), the Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1420400), the “Innovation Action Plan” International Science and Technology Cooperation Project of Shanghai (12430702000), Shanghai Alliance Program and the Humanities and Social Science Fund Project of University of Shanghai for Science and Technology (11XSY23).

2016-07-11收到初稿，2016-08-22收到修改稿。

联系人：李代禧。第一作者：潘晓莉（1991—），女，硕士研究生。