高效液相色谱法同时检测饲料中防腐剂和甜味剂

谢 勇

(国家加工食品质量监督检验中心，福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002)



高效液相色谱法同时检测饲料中防腐剂和甜味剂

谢 勇

(国家加工食品质量监督检验中心，福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002)

建立了饲料中安赛蜜，苯甲酸，糖精钠，山梨酸4种添加剂的高效液相色谱同时分离检测方法。样品用甲醇(1+1) 溶液提取，采用XB-C18色谱柱分离，以甲醇-20 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相梯度洗脱，并使用光电二极管阵列检测器于225 nm处进行检测。结果表明，4种添加剂在2～100 mg/L范围内均具有良好的线性关系，且相关系数为0.9995～1.0000，各添加剂检出限均在1.06 mg/kg以下，样品的平均回收率为94.8%～104%，相对标准偏差(n=6)为1.0%～5.3%。该方法简单快速，定量准确可靠，适用于饲料中防腐剂和甜味剂的日常检测。

饲料; 安赛蜜;苯甲酸;糖精钠;山梨酸;高效液相色谱

防腐剂(苯甲酸，山梨酸)添加于饲料中，可以抑制霉菌、酵母菌及好气性细菌的活性，延长饲料的保存期限[1]；甜味剂(安赛蜜，糖精钠)添加于饲料中，可掩盖饲料原有的不良味道，以增进家畜禽类的采食量，促进饲料的消化吸收和利用率[2]。但上述4种添加剂均属人工合成，长期或超量使用对动物体肝肾等脏器都有一定的危害[3]。

当前，对防腐剂(苯甲酸，山梨酸)和甜味剂(安赛蜜，糖精钠)的测定方法主要包括离子色谱法[4-5]、气相色谱法[6]、液相色谱-质谱联用法[7-8]、高相液相色谱法[9-10]等。4种添加剂检测的文献报道与国家标准目前主要集中于食品领域，而饲料中4种添加剂的同时快速分离检测尚未见报道。因此本文研究建立了饲料中4种防腐剂和甜味剂同时快速分离检测的检测技术，可为饲料中添加剂的检测、应用提供技术支撑。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪配Waters 2998 PDA检测器；DS-8510超声波发生器，上海生析超声仪器有限公司；Milli Q超纯水制备器，美国Millipore公司。

甲醇(色谱纯)，山东禹王实业有限公司；乙酸铵(98.0%，分析纯)，西陇化工股份有限公司。

苯甲酸(1.00 mg/mL)，糖精钠(1.00 mg/mL)，山梨酸(1.00 mg/mL)，中国计量科学研究院；安赛蜜(99.9%)，中国西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2 标准储备液和工作溶液配制

添加剂单标准储备液的配制：精确称取安赛蜜标准品100 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL，配制成浓度为1000 mg/L的安赛蜜单标准储备液。

添加剂混合标准工作溶液的配制：将添加剂单标准储备液采用逐级稀释的方法，用甲醇-水溶液 (1+1) 配制浓度从2～100 mg/L之间的系列标准混合工作溶液。所有标准储备液和标准工作溶液均置于冰箱中0 ～ 4 ℃温度下保存。

1.3 样品前处理

称取饲料样品5.0 g于100 mL的烧杯中，加入30 mL 甲醇-水(1+1)，于超声波振荡器中超声萃取30 min后，转移至50 mL 的容量瓶中，加入200 g/L 乙酸锌和100 g/L 亚铁氰化钾溶液各2 mL 沉淀蛋白，甲醇-水溶液 (1+1) 定容至刻度线。上述提取液经4000 r/min离心5 min后，取上清液，以0.22 μm滤膜过滤，滤液供分析用。

1.4 色谱条件

色谱柱：XB-C18柱(4.6 mm×150 mm)，5 μm，美国Welch公司；柱温：35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；波长：225 nm。流动相：A，20 mmol/L乙酸铵溶液；B，甲醇。梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～6 min，90%A线性降低至10%A；6～10 min，保持10%A；10～11 min，10%A线性增至90%A；11～15 min，保持90%A。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

考察了symmetry-C18和XB-C18色谱柱对4种添加剂的分离效果，结果如图1所示。在同样流动相条件下，相比于symmetry-C18柱(图1A)，XB-C18柱(图1B)有更好的峰形和分离效果，因此本实验选用XB-C18柱为分离色谱柱。

在同样色谱柱(XB-C18色谱柱)条件下，比较了20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(90/10)、水-甲醇溶液(90/10)和 20 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液(85/15)三种流动相体系的分离效果，结果分别如图1B、C、D所示。三种流动相体系对4种添加剂的分离效果存在差异，其中20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(90/10)的出峰效果最佳，因此选用20 mmol/l乙酸铵-甲醇溶液(90/10)为流动相。

用二极管阵列检测器全波长扫描光谱对4种添加剂进行扫描，得到4种添加剂的最大吸收波长(如图2)。比较了不同波长下4种添加剂的响应值(如图3)，兼顾各组分的灵敏度，选定了测定的最佳检测波长为225 nm。

图2 各分析物的吸收光谱图

图3 不同波长下分离色谱图

2.2 提取溶剂的选择

比较了甲醇、甲醇(1+1)溶液以及水3 种提取溶剂对加标样品(加标浓度为25 mg/L) 中4种添加剂的提取效率，结果显示，3 种提取溶剂均能达到满意的提取效果，其回收率为98.2%～102.5%。由于考虑到防腐剂和甜味剂各自分别易溶于甲醇和水，因此实验选择甲醇(1+1)溶液作为提取剂。

2.3 标准曲线方程、线性范围、相关系数及检出限

将1000 mg/L的各种添加剂单标准溶液采用依次稀释配制成质量浓度为100、50、25、10、5、2 mg/L的系列混合标准溶液，根据各峰面积(Y)对质量浓度(X, mg/L)绘制标准曲线，得到线性回归方程。4种添加剂的线性方程、线性范围、相关系数及检出限(信噪比S/N=3)见表1。结果表明，在2～100 mg/L质量浓度范围内，4种添加剂的线性关系良好, 相关系数(r)不小于0.9995。其检出限为0.52～1.06 mg/kg。

表1 4种添加剂的回归方程、线性相关系数、线性范围、检出限

2.4 回收率和精密度

以饲料空白基质样品进行加标回收试验，加标水平分别为50 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg，每个水平平行测定6次，平均加标回收率为94.8%～104%，相对标准偏差(RSD)为1.0%～5.3% (见表2)。结果表明，该方法准确度较高，具有良好的精密度，可用于饲料中添加剂的日常分析检测。

表2 不同样品中4种分析物加标回收率及其相对标准偏差(n=6)

2.5 实际样品分析

应用本方法对市售20种饲料样品进行检测，1份样品检出糖精钠，含量为343 mg/kg，其它3种添加剂均未检出。图4为阳性样品的色谱图。

图4 阳性样品色谱图

3 结 论

本文建立了高效液相色谱-光电二极管阵列检测法同时分离检测饲料中4种防腐剂和甜味剂。实验结果表明，本方法简单快速，定量准确可靠，可满足饲料中多种添加剂快速分离检测要求，具有较高的实用价值和应用前景。

[1] 张静, 赵立军, 李云, 等. 高效液相色谱法测定饲料中苯甲酸和山梨酸的含量[J]. 饲料研究, 2013(5):69-73.

[2] 刘芳, 吕元勋, 汪志强, 等. 饲料甜味剂的研究现状与发展趋势[J]. 饲料工业, 2009, 30(18):56-58.

[3] 刘宁, 沈明浩.食品毒理学[M].北京:中国轻工业出版社, 2007:307-308.

[4] 陈志涛, 张睿, 郑香平,等. 离子色谱法测定葡萄酒中的山梨酸和苯甲酸的含量[J]. 理化检验-化学分册, 2015, 51(12):1658-1660.

[5] 李静, 王雨, 梁立娜. 离子色谱法同时测定食品中3种甜味剂和2种防腐剂[J]. 食品科学, 2011, 32(12):239-242.

[6] 庞楠楠, 迪丽努尔·马力克, 牛蓓, 等. 快速气相色谱法测定食品中的常见防腐剂[J]. 分析试验室, 2005, 24(3):48-52.

[7] 刘晓霞, 丁利, 刘锦霞,等. 高效液相色谱-串联质谱法测定食品中6种人工合成甜味剂[J]. 色谱, 2010, 28(11): 1020-1025.

[8] 许秀敏, 吴西梅, 梁春穗,等. 液相色谱-质谱联用检测食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(9): 1057-1059.

[9] 陈英,谢晓烽,狄俊伟. 高效液相色谱法测定食品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸[J]. 理化检验-化学分册, 2007, 43(10):887-888.

[10]程盛华,丁丽,林玲,等. 高效液相色谱法同时测定月饼中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠[J]. 食品科学, 2008, 29(6):376-378.

Simultaneous Determination of Preservatives and Sweeteners in Feeds by High Performance Liquid Chromatography Detection

XIEYong

(National Center of Processed Foods Quality Supervision and Inspection, Fujian Inspection and Research Institute for Qroduct Quality, Fujian Fuzhou 350002, China)

A simple and efficient method based on high performance liquid chromatography (HPLC) was established to separate four analytes of additive (acesulfame potassium, benzonic acid, saccharin sodium, and sorbic acid) in feeds. The samples were initially extracted with methanol and water (1+1), then separated on an XB-C18column with methanol and 20 mmol/L ammonium acetate and methanol solution. Photo diode array detector was adopted with the detective wavelength of 225 nm. The result indicated that all the 4 additives had good linearities within 2～100 mg/L with the correlation coefficients between 0.9995 ～ 1.0000. The limits of detection were all less than 1.06 mg/kg. The average recoveries for the additives ranged from 94.8% to 104% with the RSDs less than 5.3%. The results showed the method was simple，rapid and reliable for the determination of preservatives and sweeteners in feeds.

feeds; acesulfame potassium; benzonic acid; saccharin sodium; sorbic acid; high performance liquid chromatography

谢勇(1976-)，男，工程师，研究方向：食品、化妆品与饲料安全检测。

S816.17

A

1001-9677(2016)022-0107-03