杏鲍菇液体种子发酵培养基优化

邓清仙，侯潞丹，贺志斌，张杰，3*

（1.山西师范大学后勤管理处房产科，山西临汾041000；2.山西师范大学生命科学学院，山西临汾041000；3.国家微生物肥料技术研究推广中心第24号技术推广站，山西临汾041000）

杏鲍菇液体种子发酵培养基优化

邓清仙1，侯潞丹2，贺志斌2，张杰2，3*

（1.山西师范大学后勤管理处房产科，山西临汾041000；2.山西师范大学生命科学学院，山西临汾041000；3.国家微生物肥料技术研究推广中心第24号技术推广站，山西临汾041000）

该研究通过响应面试验设计方法对杏鲍菇液体种子发酵培养基组成成分进行了优化，探讨4个不同单因素对杏鲍菇菌丝干质量的影响。结果表明，最佳的培养基配方为马铃薯100 g/L，麦麸30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40 g/L，KH2PO40.85 g/L，MgSO41 g/L。在此配方下，杏鲍菇菌丝干质量高达1.885 1 g/100 mL。这不仅为杏鲍菇液体种子发酵提供依据，同时也为其栽培提供依据。

杏鲍菇；液体种子；培养基优化；响应面分析

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，属真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是一种珍稀食用菌，也被称平菇王。因为其营养价值高且口感好、低脂肪、低热量，因此受到全球人们的喜爱[1-3]。

当前的研究主要集中于杏鲍菇栽培技术[4-6]，在杏鲍菇规模化生产过程中，多数选用固体菌种培养，其具栽培周期长、污染率高、菌体内菌龄相差悬殊、出菇不齐，不利于规模化和机械化生产等缺点。液体制种周期短、发菌速度快、污染率低，有利于杏鲍菇生产的工厂化以及现代化[7]。为了缩短杏鲍菇制种及生产周期，提高产量和质量，大批学者对液体制种做了详细研究，而在液体发酵过程中，碳源不仅维持其正常生长，而且提供杏鲍菇合成碳水化合物和氨基酸的骨架，而氮源则是杏鲍菇合成蛋白质和核酸的必要元素[8]，因此筛选出一种适用于杏鲍菇生长的培养基非常重要[9]。而响应面方法（response surface method，RSM）是一种有效的方法，其广泛应用于优化[10-11]。本研究采用响应面法对杏鲍菇液体种子发酵培养基的组分进行了筛选及优化，得出了杏鲍菇液体种子发酵所需的最适培养基配方，这不仅可以缩短液体种子发酵周期，也可为杏鲍菇高质量的栽培提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）：四川省农业科学院微生物研究中心；马铃薯葡萄糖琼脂、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、MgSO4、KH2PO4：天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

FA22O4B型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；PH-3CX酸度计：上海雷磁有限公司；YXO-LS-50-SII型全自动高压灭菌器、SPX-250B-D型数显振荡培养箱、SW-CJ-2FD双人垂直超净工作台、DEF-6050MBE真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；Z36HK台式高速冷冻离心机：德国赫默公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

将杏鲍菇菌种接种到试管斜面上，置于28℃恒温培养箱中培养7 d备用；将斜面菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）平板上28℃恒温培养箱中培养5 d可得平板菌种，供碳氮源优选试验使用。

通过无菌操作技术，使用打孔器将平板菌种进行打孔，并接至装有PDA液体培养基的锥形瓶中，且锥形瓶装液量为100 mL/250 mL，每瓶接种3块菌柄，置于120 r/min、28℃恒温振荡培养箱中培养5 d，可得一级种子液。

1.3.2 最佳碳源筛选试验

基础发酵培养基配方为马铃薯100 g/L，麸皮30 g/L，蛋白胨1.5 g/L，MgSO40.9 g/L，KH2PO41.5 g/L，pH值自然[12]，分别添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉5种碳源，其含量为30 g/L。将菌柄接种到平板中央，每24 h采用十字交叉法测量菌落直径并记录，计算菌丝生长速度，待培养结束后拍照比较菌丝长势，综合比较来确定杏鲍菇菌种培养最适碳源。

1.3.3 最佳氮源筛选试验

以葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、琼脂20 g/L为基础培养基配方，以玉米粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、KNO36种氮源为单一变量分别配制培养基，灭菌后倒制平板备用。每24 h采用十字交叉法测量菌落直径并记录，计算菌丝生长速度，待培养结束后拍照比较菌丝长势，综合比较来确定杏鲍菇菌种培养最适氮源。

1.3.4 培养基优化单因素试验

在基础发酵培养基基础上，分别调整添加碳源含量（15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L），氮源含量（1.0 g/L、1.5 g/L、3.0 g/L、4.5 g/L、6.0 g/L）[13]，根据试验结果来确定最适碳源、氮源的添加量。

1.3.5 响应面法对杏鲍菇液体菌种发酵条件的优化

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design g/L

在单因素试验的基础上，采用响应面法优化发酵培养基，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以发酵培养基蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、MgSO4（X3）、KH2PO4（X4）添加量4个因素为自变量，以菌丝产量即菌丝干质量（Y）为响应值，设计了优化杏鲍菇液体菌种培养基的4因素3水平试验。试验设计、数据处理和模型建立皆采用Design Expert（Version 8.0.6）来进行统计分析。响应面设计因素及水平编码见表1。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对杏鲍菇菌丝生长速度的影响作用

由图1可知，杏鲍菇菌丝长势随着培养基的碳源不同存在明显差异。以葡萄糖为碳源菌丝洁白、浓密，但菌落形态不完整；以麦芽糖和淀粉为碳源比以葡萄糖为碳源菌落形态完整，但菌丝稀疏，且不健壮，这主要是因为真菌利用单糖的能力要高于双糖和多糖；以乳糖为碳源比以葡萄糖为碳源菌落形态稍完整，且菌丝洁白、浓密、健壮；以蔗糖为碳源比以前4种物质为碳源菌落形态完整，菌丝洁白、浓密、健壮。因此杏鲍菇菌丝在以上5种不同碳源中长势有好到差依次为：蔗糖（3.402mm/d）＞麦芽糖（2.526mm/d）＞淀粉（1.734mm/d）＞乳糖（1.601mm/d）＞葡萄糖（0.932mm/d）。因此，选择蔗糖为最适碳源。

图1 不同碳源培养基对杏鲍菇菌丝长势的影响Fig.1 Effect of different carbon sources of medium on the growth ofP.eryngiimycelia

图2 不同蔗糖含量对杏鲍菇菌丝干质量的影响Fig.2 Effect of different sucrose contents on dry mass of P.eryngiimycelia

基础培养基中添加分别不同量的蔗糖（15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）对杏鲍菇菌丝干质量的影响结果见图2。由图2可知，当蔗糖含量在15～25 g/L时，菌丝干质量随着蔗糖含量增加而显著性增加；且在蔗糖添加量为25 g/L时，菌丝干质量达到最大值；随后，菌丝干质量随着蔗糖添加量的增加而下降。因此，杏鲍菇液体种子发酵培养基中蔗糖最适添加量为25 g/L。

2.2 不同氮源对杏鲍菇菌丝生长速度的影响作用

由图3可知，杏鲍菇菌丝长势随着培养基中氮源种类的不同存在明显差异。以蛋白胨为氮源菌丝洁白、浓密，且菌落形态完整；以玉米粉和KNO3为氮源菌落形态完整，但菌丝稀疏，且不健壮；以酵母膏为氮源菌丝洁白、浓密、健壮，但菌落形态不完整；以牛肉膏为氮源菌丝洁白、浓密、健壮，但菌落形态不完整。因此，菌丝在以上不同氮源中长势由好到差次序为：蛋白胨（3.123 mm/d）＞玉米粉（3.567 mm/d）＞KNO3（3.054 mm/d）＞牛肉膏（2.590 mm/d）＞酵母膏（2.147 mm/d）＞尿素（0 mm/d）。因此，选择蛋白胨为最适氮源。

图3 不同氮源培养基对杏鲍菇菌丝长势的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources of medium on the growth ofP.eryngiimycelia

不同的蛋白胨含量对杏鲍菇菌丝干质量的影响，结果见图4。由图4可知，随着蛋白胨含量的增加，杏鲍菇菌丝干质量呈现先上升后下降的趋势，且在蛋白胨含量为1.5 g/L时，菌丝干质量达到最大值（1.22 g/100 mL）。因此，杏鲍菇液体种子发酵培养基中最适蛋白胨含量为1.5 g/L。

图4 不同蛋白胨含量对杏鲍菇菌丝干质量的影响Fig.4 Effect of different peptone contents on dry mass of P.eryngiimycelia

2.3 响应面分析法优化杏鲍菇液体发酵培养基成分

响应面法常被应用在多个因素存在的优化研究工作中，其具有节约时间、空间以及原材料等优点[14]。本实验设计的29组试验组，其中1～24组为析因试验，25～29组为中心试验。响应面设计结果见表2，响应面回归模型方差分析，结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通过Design-Expert 8.0.6对表2中的数据进行响应面回归分析，得到二次多项回归拟合方程：

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回归模P＜0.001，表现为显著，同时失拟项P=0.275 4，表现为不显著。二次回归模型中决定系数R2=0.857 0，调整决定系数Radj2=0.719 3，说明有85.70%的差异可以用这个回归模型来解释。由此可知，该回归模型拟合度良好。由表3可知，一次项X1，交互项X1X3对菌丝干质量表现为显著影响（P＜0.05），而二次项X22、X22、X32、X42对菌丝干质量表现为极显著影响（P＜0.01）。4个因素对菌丝干质量影响作用从大到小依次为X1＞X3＞X4＞X2。

2.4 响应面分析[15-16]

将上述回归方程的图形化表示，响应曲面及等高线结果见图5。由图5（a）可知，蛋白胨与蔗糖两因素的交互作用虽对菌丝干质量得率有一定的影响作用，但该作用并不显著。由图5（b）可知，蔗糖与KH2PO4交互作用显著的影响了杏鲍菇菌丝干质量（P＜0.05）。由图5（c）、5（d）、5（e）、5（f）可知，蔗糖与MgSO4、蛋白胨和KH2PO4、蛋白胨与MgSO4及KH2PO4和MgSO4之间的交互作用均对菌丝干质量得率的影响不显著（P＞0.05）。

图5 蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4交互作用对杏鲍菇菌丝干质量影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose,peptone, KH2PO4and MgSO4on the dry mass ofP.eryngiimycelia

2.5 杏鲍菇液体发酵培养基配方的优化与验证结果分析

运用Design-Expert 8.0.6软件所获得杏鲍菇液体种子发酵培养基的最佳配方为：马铃薯100 g/L，麦麸30 g/L，蔗糖26.87 g/L，蛋白胨1.42 g/L，KH2PO40.85 g/L，MgSO41.05 g/L。此配方计算出来杏鲍菇菌丝干质量为1.917 0 g/100 mL。考虑到实际的生产操作，培养基成分的优化参数修改为马铃薯100 g/L，麦麸30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40 g/L，KH2PO40.85g/L，MgSO41g/L，在此条件下菌丝体干质量为1.885 1 g/100 mL。结果表明真实值与预测值间无显著性差异。

3 结论

本实验通过使用响应面法试验设计对杏鲍菇液体种子发酵培养基进行了优化。结果表明最佳的液体种子发酵培养基配方为：马铃薯100 g/L，麦麸30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40g/L，KH2PO40.85g/L，MgSO41g/L。在此最佳培养基配方条件下下，杏鲍菇菌丝干质量为1.8851g/100mL。这不仅为杏鲍菇液体种子发酵提供依据，同时也为其栽培提供依据。

本研究在此基础上得出了最适碳源、氮源，进一步探究了发酵培养基的最佳配比。但是有关杏鲍菇液体菌种的培养条件的探究以及新型废弃料的栽培还需要进一步深入研究。

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Optimization of medium compositions for liquid seed fermentation ofPleurotus eryngii

DENG Qingxian1,HOU Ludan2,HE Zhibin2,ZHANG Jie2,3*
(1.Housing Administrative Office,Logistics Management Department,Shanxi Normal University,Linfen 041000,China; 2.School of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen 041000,China;3.The No.24 Technology Extending Station, the National Technology Research and Extension Center of Microbial Fertilizer,Linfen 041000,China)

The medium compositions for liquid seed fermentation ofPleurotus eryngiiwere optimized by response surface methodology.The effects of four factors on dry mass ofP.eryngiimycelia were investigated.The results showed that the optimal medium compositions were potato 100 g/L, wheat bran 30 g/L,sucrose 27 g/L,peptone 1.40 g/L,KH2PO40.85 g/L and MgSO41 g/L.Under the conditions,the dry mass ofP.eryngiimycelia was up to 1.885 1 g/100 ml,which not only provided the basis for liquid seed fermentation ofP.eryngii,and also provided the basis for their cultivation.

Pleurotus eryngii;liquid seed;medium optimization;response surface methodology

Q939.96

0254-5071（2016）11-0128-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.026

2016-08-12

山西师范大学科技开发基金项目（YK1201）

邓清仙（1963-），女，高级实验师，本科，主要从事园林、园艺、农学等方面的应用工作。

*通讯作者：张杰（1978-），男，副教授，博士，主要从事微生物肥料的研发、生产工作。