马索罗酚对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠IL-6、IL-17、TGF-b表达的影响

李彬　张彦博　孔鹏　张静　陈丽萍　郭力

·论 著·

马索罗酚对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠IL-6、IL-17、TGF-b表达的影响

李彬*张彦博*孔鹏*张静*陈丽萍*郭力*

目的观察马索罗酚（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠IL-6、IL-17、TGF-β表达的影响。方法采用MOG35-55多肽为抗原免疫C57BL/6小鼠制备EAE模型。小鼠随机分成对照组、模型组和治疗组，各组18只。治疗组给予马索罗酚10 mg/(kg·d)干预，对照组及模型组给予等量溶剂干预。分别在发病后10 d、20 d进行神经功能评分后取材，采用实时定量PCR方法检测小鼠腰髓和脾组织IL-6、IL-17、TGF-bmRNA表达水平，采用ELISA方法检测脑组织IL-6、IL-17、TGF-b蛋白表达水平。结果 模型组与治疗组发病10 d、20 d时神经功能评分为（7.22±1.10）、（4.22±0.97），（2.89±1.05）、（1.33±0.71），差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组与模型组比较结果如下。脊髓组织：①IL-6水平发病10 d时（8.54±2.49）、（14.07±3.19），差异有统计学意义（P＜0.05）；发病20 d时（4.26±1.44）、（4.90±1.24），差异无统计学意义（P＞0.05）。②IL-17水平发病10 d时（25.50±11.77）、（47.59±8.01）；发病20 d时（10.02±2.99）、（20.14±4.57），差异均有统计学意义（P＜0.05）。③TGF-b水平发病10 d时（0.74±0.11）、（0.04± 0.01）；发病20 d时（1.49±0.30）、（0.59±0.23），差异均有统计学意义（P＜0.05）。脑组织（pg/mL）：①IL-6水平发病10 d时（44.58±6.94）、（57.46±7.32）；发病20 d时（35.85±9.58）、（51.29±2.09），差异均有统计学意义（P＜0.05）。②IL-17水平发病10 d时（515.90±63.10）、（899.89±242.39）；发病20 d时（437.71±137.35）、（730.32±139.94），差异均有统计学意义（P＜0.05）。③TGF-b水平发病10 d时（170.88±24.69）、（132.85±20.27）；发病20 d时（229.59± 32.10）、（172.58±16.94），差异均有统计学意义（P＜0.05）。脾组织：①IL-6水平发病10 d时（6.51±1.29）、（19.76± 5.85），差异有统计学意义（P＜0.05）；发病20 d时（3.13±0.78）、（4.14±0.58），差异无统计学意义（P＞0.05）。②IL-17水平发病10 d时（2.08±1.19）、（7.50±1.31）；发病20 d时（0.67±0.41）、（2.75±0.44），差异均有统计学意义（P＜0.05）。③TGF-b水平发病10 d时（0.61±0.16）、（0.08±0.02）；发病20 d时（1.77±0.39）、（0.50±0.33），差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论马索罗酚可以改善EAE小鼠病情，其作用机制可能与下调IL-6、IL-17表达，上调TGF-b表达有关。

马索罗酚 实验性自身免疫性脑脊髓炎 白细胞介素6白细胞介素17转化生长因子b

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以炎性脱髓鞘和轴索损伤为特征、由免疫介导的中枢神经系统疾病[1]，其主要病理生理过程包括异常的免疫应答及氧化应激[2]。研究显示，Nrf2/ARE通路激活剂可通过调节免疫及抗氧化双重作用对MS的动物模型产生保护作用[3]。马索罗酚（nordi⁃hydroguaiaretic acid,NDGA）为一种新的Nrf2/Ke⁃ap1/ARE通路激活剂[4]，对中枢神经系统变性疾病和缺血再灌注损伤有保护作用。但NDGA是否对MS具有潜在的治疗作用尚未见报道。本实验通过NDGA干预的动物实验，探索其作用机制及对MS的治疗作用。前言一段即可，请尽量不要出现科普类语言，简要介绍研究背景和目的即可。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雌性C57BL/6小鼠54只，体重18～20 g，周龄8～10周，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2实验动物分组将54只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组18只。各组再随机分为10 d组、20 d组，每亚组9只。各亚组中，5只小鼠用于ELISA检测，4只用于实时定量PCR检测。自发病（weaver评分≥1分）当天（记为第0天）起至处死，治疗组给予腹腔注射NDGA（百灵威科技有限公司）溶液10 mg/（kg.d），对照组及模型组给予等量5%DMSO（Sigma）10 mL/（kg.d）腹腔注射。

1.3动物模型制备及神经功能评分 取抗原MOG35-55（西安霖肽生物科技有限公司）溶于生理盐水，稀释为5 mg/mL溶液后加入等体积完全弗氏佐剂（Sigma），充分乳化后按每只0.1 mL于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，并分别于免疫后第0 h及第48 h腹腔注射500 ng PTX（ENZO corpora⁃tion），制作模型组及治疗组EAE模型[3]。对照组以相同方法给予等量生理盐水。

神经功能评分采用weaver（15分）法，标准如下。尾巴：无症状0分，张力减低或远端瘫痪1分，全瘫2分；四肢：无症状0分，步态不稳1分，肢体轻瘫、行走时肢体拖曳2分，肢体全瘫、行走时肢体外翻3分。逐一评价，分值累加。小鼠死亡时15分[5]。计算各组小鼠神经功能评分均值。

1.4实时荧光定量 PCR 检测 IL-6、IL-17、TGF-βmRNA水平取小鼠腰髓及脾组织，提取总RNA，应用All-in-One™First-Strand cDNA Syn⁃thesis Kit试剂盒（复能基因公司）反转录合成cD⁃NA，根据All-in-One™ qPCR Mix试剂盒（复能基因公司）说明书进行实时定量PCR检测。GAPDH作为内参。扩增条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，重复45个循环。70℃至95℃绘制熔解曲线。根据目的基因与内参基因的Ct差值，计算IL-6、IL-17、TGF-b mRNA相对水平。

1.5ELISA方法检测IL-6、IL-17、TGF-β蛋白表达水平取脑组织，以4℃混有蛋白酶抑制剂的0.1%PBS溶液配成10%脑组织匀浆液，置于4℃5000 r/min离心10 min。取上清液，采用小鼠定量分析酶联免疫检测试剂盒（中国上海巧伊生物科技有限公司），按照说明书操作，检测组织中IL-6、IL-17、TGF-b蛋白含量。

1.6统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组比较应用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α为0.05。

2　结果

2.1基线资料 实验用药前，对照组小鼠体重（19.1±0.8）g，模型组（19.2±0.9）g，治疗组（19.0± 0.3）g，3组体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。神经功能评分3组均为0分。

2.2神经功能评分对照组小鼠无发病，体重渐增，反应灵敏，尾部有张力。模型组及治疗组小鼠免疫后全部发病，大部分以尾部张力下降为首发症状，发病后症状逐渐加重，继之出现后肢无力、瘫痪、严重者累及双前肢，治疗组症状相对较轻，进入缓解期后，症状较前好转，肢体无力较前减轻。治疗组平均神经功能评分较模型组显著降低（P＜0.05）（见表1）。

2.3脊髓及脾组织IL-6、IL-17、TGF-b mRNA水平 发病10 d时，与对照组相比，模型组及治疗组小鼠脊髓及脾组织IL-6、IL-17 mRNA水平增高（P＜0.05），TGF-β mRNA水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠脊髓及脾组织IL-6、IL-17 mRNA水平降低（P＜0.05），TGF-β mRNA水平增高（P＜0.05）（表2、3）。

表1　各组小鼠神经功能评分（n=9）

表2　各组小鼠脊髓组织炎症因子mRNA表达水平（n=4）

发病20 d时，与对照组相比，模型组及治疗组小鼠脊髓及脾组织IL-6、IL-17 mRNA水平增高（P＜0.05）。与对照组比较，模型组TGF-b mRNA水平无统计学差异（P＞0.05），治疗组TGF-b mRNA水平增高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠脊髓及脾组织IL-17 mRNA水平降低，TGF-b mRNA水平增高（P＜0.05），IL-6 mRNA水平无统计学差异（P＞0.05）（表2、3）。

2.4脑组织IL-6、IL-17、TGF-β蛋白表达水平发病10 d时，与对照组相比，模型组及治疗小鼠脑组织IL-6、IL-17含量增高（P＜0.05），模型组TGF-β含量降低（P＜0.05）；治疗组TGF-β表达无明显差异（P＞0.05）。与模型组相比，治疗组小鼠IL-6、IL-17含量降低（P＜0.05），TGF-β含量增高（P＜0.05）（表4）。

发病20 d时，与对照组相比，模型组小鼠脑组织IL-6、IL-17含量增高（P＜0.05），TGF-β含量无明显差异（P＞0.05）；与对照组相比，治疗组IL-6、IL-17含量无明显差异（P＞0.05），TGF-β含量增高（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组小鼠脑组织IL-6、IL-17含量降低（P＜0.05），治疗组TGF-b较模型组增高（P＜0.05）（表4）。

3　讨论

MS病因目前尚不完全明确，但髓鞘蛋白激活的CD4+T细胞及其相关细胞因子在MS的急性炎症病变和疾病进展中的重要作用已被试验所证实[6]，后者包括IL-6、IL-17、TGF-b等。这些细胞因子在破坏血脑屏障、杀伤神经元、影响神经干细胞增殖和促进少突胶质细胞凋亡等方面起着重要作用[7]。马索罗酚以抗炎、抗氧化为特征，通过调节Nrf2/ ARE通路、减少促炎介质释放、抑制神经元凋亡，在许多炎症疾病如肝、肾损伤和神经变性疾病中均有细胞保护作用[4]。但目前并没有NDGA用于MS治疗的研究，本文重点研究NDGA对EAE模型中细胞因子的变化的影响。本研究主要针对EAE模型中枢神经系统病变进行研究，故研究组织选择大脑和脊髓；此外，脾脏含有丰富的淋巴组织，其同样是单核-巨噬系统的重要实体器官，在免疫应答中起重要作用[8-10]，故本研究中同样纳入脾组织进行分析。

表3　各组小鼠脾组织炎症因子mRNA表达水平（n=4）

表4　ELISA法检测各组小鼠脑组织炎症因子蛋白表达水平（n=5）

本实验应用NDGA治疗EAE小鼠，治疗组小鼠的症状评分比模型组明显降低，表明NDGA可以显著改善EAE小鼠临床表现，提示其可以在MS中起到保护神经细胞的功能。目前已知IL-6、IL-17在EAE病程中发挥促炎作用，而TGF-b在缺乏IL-6条件下促使T细胞向Treg细胞分化起抗炎作用。本研究中，急性期模型组小鼠IL-6、IL-17的转录和蛋白表达水平均增高，TGF-b的转录和蛋白表达水平降低；缓解期IL-6、IL-17水平较急性期下降，而TGF-b水平较急性期回升。提示NDGA的神经保护功能可能与改变这些细胞因子的表达相关。一些研究也发现了类似的现象：在Nrf 2小鼠颅脑损伤的研究中NDGA可以减少炎性介质包括IL-6等分泌[11]。在硫唑嘌呤诱发的肾病模型中，NDGA恢复了其TGF-β的表达，在避免肾功能损伤的同时，减少了蛋白尿[12]。除此之外，本研究中还涉及了NDGA与IL-17的关系。IL-17是近年来新发现的炎症介质，目前相关研究较少，更没有与NDGA相关的报道。与传统的IL-6、TGF-β不同，IL-17是通过促进中性粒细胞募集；促进CCL2、IL-6和IL8产生，引起血脑屏障中血管内皮细胞中活性氧产生；破坏紧密连接蛋白表达和内皮细胞弹性，导致血脑屏障破坏等发挥其促炎作用[13]。本研究证实NDGA可抑制IL-17表达，而IL17水平的降低与减少EAE中枢神经系统炎性浸润和髓鞘脱失有重要关联。

通过NDGA治疗组和模型组的比较，我们发现NDGA可减少IL-6、IL-17基因转录和翻译，从而降低Th17细胞分化；提高TGF-β转录和翻译，促进Treg细胞分化，抑制EAE小鼠的异常炎症反应。这一结果提示NDGA可能是通过纠正Th17/ Treg细胞因子失衡，并影响初始T细胞的分化和繁殖对疾病进程干预。虽然MS的免疫机制错综复杂，需要进一步的研究和探索，但NDGA可以改善EAE小鼠的症状评分和平衡炎症相关因子。

综上，本实验结果表明NDGA可以缓解EAE小鼠神经系统症状，下调促炎因子IL-6、IL-17的转录和翻译、上调炎症抑制因子TGF-β的转录和翻译，显示出神经保护作用和免疫抗炎特性，为多发性硬化治疗提供了新的可能途径。

[1]KOCH-HENRIKSEN N,SRENSEN PS.The changing demo⁃graphic pattern of multiple sclerosis epidemiology[J].Lancet Neurol,2010,9(5)：520-532.

[2]姜红,刘广志,周建华,等.多发性硬化抗原特异性调节性T细胞的免疫活性[J].中国神经精神疾病杂志,2015,41(3)：180-182.

[3]LI B,CUI W,LIU J,et al.Sulforaphane ameliorates the develop⁃ment of experimental autoimmune encephalomyelitis by antago⁃nizing oxidative stress and Th17-related inflammation in mice [J].Exp Neurol,2013,250(4)：239-249.

[4]HERNÁNDEZ-DAMIÁN J,ANDÉRICA-ROMERO AC,PE⁃DRAZA-CHAVERRI J.Paradoxical Cellular Effects and Bio⁃logical Role of the Multifaceted Compound Nordihydroguaiaret⁃ic Acid[J].Arch Pharm(Weinheim),2014,347(10)：685-697.

[5]马可,陈雄,郑俊炯,等.多发性硬化动物模型神经功能评分的比较与改良[J].中国神经精神疾病杂志,2015,41(11)：679-684.

[6]YANG L,ANDERSON DE,BAECHER-ALLAN C,et al.IL-21 and TGF-β are required for differentiation of human TH17 cells [J].Nature,2008,454(7202)：350-352.

[7]GRIFFIN GK,NEWTON G,TARRIO ML,et al.IL-17 and TNF-α sustain neutrophil recruitment during inflammation through synergistic effects on endothelial activation[J].J Immu⁃nol,2012,188(12)：6287-6299.

[8]MAVRA M,NEWCOMBE J,KEIR G,et al.Spleen versus CNS immunoglobulin G in multiple sclerosis：an isoelectric focusing study[J].Acta Neurologica Scandinavica,1990,81(2)：125-127.

[9]CHEN C,YU J Z,ZHANG Q,et al.Role of Rho Kinase and Fa⁃sudil on Synaptic Plasticity in Multiple Sclerosis[J].Neuromo⁃lecular Medicine,2015,17(4)：454-465.

[10]TRINSCHEK B,LUESSI F,GROSS CC,et al.Interferon-Beta Therapy of Multiple Sclerosis Patients Improves the Responsive⁃ness of T Cells for Immune Suppression by Regulatory T Cells [J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(7)：16330-16346.

[11]JIN W,WANG H,YAN W,et al.Disruption of Nrf2 Enhances Upregulation of Nuclear Factor-κB Activity,Proinflammatory Cytokines,and Intercellular Adhesion Molecule-1 in the Brain after Traumatic Brain Injury[J].Mediators Inflamm,2009, 2008：725174.

[12]LEE DW,KWAK IS,LEE SB,et al.Effects of celecoxib and nordihydroguaiaretic acid on puromycin aminonucleoside-in⁃duced nephrosis in the rat[J].J Korean Med Sci,2009,24(S1)：S183-S188.

[13]HUPPERT J,CLOSHEN D,CROXFORD A,et al.Cellular mechanisms of IL-17-induced blood-brain barrier disruption [J].FASEB J,2010,24(4)：1023-1034.

（责任编辑：李立）

NDGA ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis via the regulation of IL-6,IL-17 and TGF-b.

LI Bin,ZHANG Yanbo,KONG Peng,ZHANG Jing,CHEN Liping,GUO Li.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University；Key Laboratory of Hebei Neurology，Shijiazhuang050000,China.Tel：0311-6603921.

Objective To investigate the effects of nordihydroguaiaretic acid(NDGA)on the expression of IL-6, IL-17 and TGF-β in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods C57BL/6 mice were immu⁃nized with MOG35-55 to induce EAE.The 54 mice were randomly and equally divided into control group,model group and treatment group.Mice in treatment group were daily administered with NDGA(10 mg/kg)by intraperitoneal injection following onset of EAE.Mice in control and model groups were daily treated with equivalent vehicle.Real-time PCR was used to detect IL-6,IL-17 and TGF-b mRNA levels in the spinal cord and spleen on day 10 and 20 post treatment.ELI⁃SA was used to examine IL-6,IL-17 and TGF-b expression levels in the brain.Results The neurological deficit scores were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(7.22±1.10 vs.4.22±0.97 on 10 day,P＜0.05；2.89±1.05 vs.1.33±0.71 on 20 days,P＜0.05).The level of of IL-6 in spinal cord was significantly different between EAE group and treatment group on 10 day but not on 20 days(8.54±2.49 vs.14.07±3.19 on 10 days,P＜0.05；2.89±1.05 vs.1.33±0.71,P＞0.05).The level of IL-17 in spinal cord were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(25.50±11.77 vs.47.59±8.01 on 10 day,P＜0.05；10.02±2.99 vs.20.14±4.57 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-β in spinal cord were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(0.74±0.11 vs.0.04±0.01 on 10 day,P＜0.05；1.49±0.30 vs.0.59±0.23 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-6 in brain were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(44.58±6.94 vs. 57.46±7.32 on 10 day,P＜0.05；35.85±9.58 vs.51.29±2.09 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-17 in brain were signifi⁃cantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(515.90±63.10 vs.899.89±242.39 on 10 day, P＜0.05；437.71±137.35 vs.730.32±139.94 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-βin brain were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(170.88±24.69 vs.132.85±20.27 on 10 day,P＜0.05；229.59± 32.10 vs.172.58±16.94 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-6 in spleen was significantly different between EAE group and treatment group on 10 day but not on 20 day(6.51±1.29 vs.19.76±5.85 on 10 day,P＜0.05；3.13±0.78 vs.4.14±0.58 on 20 day,P＞0.05).The level of IL-17 in spleen on 10 day was significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(2.08±1.19 vs.7.50±1.31 on 10 day,P＜0.05；0.67±0.41 vs.2.75±0.44 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-β in spleen was significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(0.61± 0.16 vs.0.08±0.02 on 10 day,P＜0.05；1.77±0.39 vs.0.50±0.33 on 20 day,P＜0.05).Conclusions NDGA can ameliorate the development of EAE by reducing IL-6,IL-17 production and increasing TGF-β production.

Nordihydroguaiaretic acid Experimental autoimmune encephalomyelitis IL-6 IL-17 TGF-β

R744

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.09.005

☆国家自然科学基金资助项目（编号：81100884）

*河北医科大学第二医院神经内科，河北省神经病学重点实验室(石家庄050000)

（E-mail：guoli6@163.com）

2016-06-13）