植物组织培养实验的教学实践

张芸

文件编号： 1003 - 7586（2016）11 - 0052 - 02

在普通高中生物课程标准中对植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”，建议用组织培养法培养花卉等幼苗，并进行露地栽培。植物组织培养是一项操作复杂而精细、难度较大的实践活动。从操作的持续时间来看，该实验无法在一节课内完成，因此笔者利用课余时间组织兴趣小组的学生利用植物组织培养的方法培养油菜，让学生切身感受植物组织培养的全过程，培养了动手操作的能力，这不仅符合新课程倡导探究性学习的基本理念，同时为今后班级化大规模实验的开展奠定了基础。

1 实验材料

油菜种子、灭菌的培养基、体积分数为70%的酒精、体积分数为0.1%的升汞、无菌水、培养皿、培养罐、酒精灯、光照培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、解剖刀、镊子等。

2 实验方法

2.1 配制MS固体培养基

2.1.1 配制母液

（1） MS大量元素Ⅰ：41.25 g NH4NO3溶化后加8.31 g无水CaCl2，用蒸馏水定容至500 mL；

（2） MS大量元素Ⅱ：47.5 g KNO3与4.25 g KH2PO4分别溶解后混合，用蒸馏水定容至500 mL；

（3） MS大量元素Ⅲ：18.5 g MgSO4·7H2O，用蒸馏水定容至500 mL；

（4） Fe盐：3.73 g EDTA-Na与2.78 g FeSO4·7H2O，分别溶解后混合，蒸馏水定容至500 mL；

（5） MS微量元素：依次加入下列各药品，溶解后再加入后一种，最后用蒸馏水定容至500 mL

83 mg KI、620 mg H3BO3、1 690 mg MnSO4·H2O、860 mg ZnSO4·7H2O、25 mg NaMoO4·2H2O、 2.5 mg CuSO4·5H2O、2.5 mg CoCl2·6H2O。

（6） MS维生素：依次加入2 g 肌醇、10 mg 烟酸、10 mg 盐酸吡哆醛、2 mg 盐酸硫胺素、40 mg 甘氨酸等药品后用蒸馏水定容至200 mL。

（7） 6-BA母液：20 mg 6-BA加入0.2 M HCl溶化，用蒸馏水定容至100 mL；

（8） NAA母液：20 mg NAA加入0.2 M NaOH溶化，用蒸馏水定容至100 mL；

（9） 2，4-D母液：20 mg 2，4-D加入0.2 M NaOH溶化，用蒸馏水定容至100 mL；

（10） AgNO3储液：1.2 g AgNO3加蒸馏水定容至100 mL，过滤灭菌。

（11） 头孢霉素（Cef）溶液：灭菌蒸馏水配置成250 mg/mL母液；

2.1.2 配制相关培养基

（1） 种子萌发培养基：MS。

（2） 诱导培养基：MS、2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2，4-D。

（3） 分化培养基：MS。

（4） 壮苗培养基：MS+2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、6 mg/L AgNO3、50 mg/L Cef。

（5） 生根培养基：1/2 MS。

若配制MS培养基1 L，则MS大量元素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、微量元素、维生素各1 mL，Fe盐2 mL。以上培养基均加蔗糖30 g/L及琼脂8 g/L，pH调至6.2。

2.1.3 灭菌及分装培养基

将配制好的培养基连同其他用具，如培养罐、烧杯、培养皿、解剖刀、镊子、无菌水、滤纸等相关物品一起放入高压蒸汽灭菌锅中，121°C灭菌15～20 min。同时打开超净工作台的紫外灯，20 min后关闭紫外灯并开启鼓风机。待灭菌锅气压降为0后，将所有物品取出放入超净工作台。关闭超净工作台的鼓风机用酒精棉球仔细擦拭超净工作台的台面及双手，点燃酒精灯，待培养基冷却至不烫手时，在酒精灯火焰旁将培养基分装到培养罐中。

2.2 实验步骤

培养无菌苗：选取子粒饱满的油菜种子若干，在超净工作台中的酒精灯火焰旁，用酒精消毒30 s后，立即用无菌水冲洗3次，再用升汞处理5 min后，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸去种子表面水分后，将种子接种于萌发培养基中，置于25 ℃光照培养箱，光照12 h/d。

获取外植体，并诱导形成愈伤组织：待无菌苗长至7 d，分别切取下胚轴和子叶为外植体，接种于诱导培养基中，黑暗中培养，每10 d更换一次培养基。20 d后可见愈伤组织。

诱导生根：将分化约1～2 cm的绿芽切下转入壮苗培养基中待分化，芽苗长至3～5 cm时转入生根培养基中。

炼苗及移栽：待试管苗根系发达时，打开盖子炼苗3 d后移至花盆中进行露地栽培。

3 讨论

3.1 植物组织培养基中添加蔗糖的原因

作为碳源和能源物质，蔗糖比葡萄糖能更好地维持培养基内的低渗环境。如配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压明显低于葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。并且植物细胞吸收蔗糖的速率比吸收葡萄糖的速率慢很多，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。其次从能量供应来说，相同物质的量浓度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。此外，在组培过程中，要特别注意防止培养基受微生物的污染。已知微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖，而较少利用蔗糖，因此采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少微生物的污染。

3.2 选择子叶和下胚轴作为外植体的原因

研究表明，油菜子叶和下胚轴因获取方便，再生率高、易转化等特点，常被用作诱导愈伤组织及再生芽的理想材料。并且直接用种子培养无菌苗，再以无菌苗的子叶和下胚轴作为外植体，可避免消毒难、培养效果受接种时间等因素的限制。

3.3 脱分化时要避光及再分化时要光照的原因

外植体脱分化形成愈伤组织时需要避光，其目的是为了愈伤组织的形成，如果给予光照，则会不同程度地形成维管组织。愈伤组织是未分化的状态，维管组织是已分化的状态，若外植体分化成维管组织，则无法继续分化成胚状体，更无法长成植株。而愈伤组织再分化时需要光照，主要是为了叶绿素的形成。因为只有在光照条件下，植物细胞中原叶绿素酸脂还原酶才可以将原叶绿素酸脂还原为叶绿素酸脂，后者再进一步形成叶绿素。

3.4 培养过程中多次更换培养基的原因

首先，组织培养不同阶段所使用的培养基成分是不一样的，特别是植物激素的组成及比例。其次，培养过程中外植体会产生一些有毒的代谢物，因此需要定期更换培养基，以免影响培养物的生长状态。再者，培养过程中可能会受杂菌污染，若染细菌且菌斑不大，可及时将其他未接触到菌的外植体换至新的培养基中。

3.5 组培苗移栽前炼苗的原因

组培苗虽具有一定的光合能力，但处于高湿、弱光、低CO2、恒温、异养条件下生长，其组织分化不完善，光合自养能力弱，气孔多且不易关闭、叶绿素少、根毛少。移栽前炼苗则是为了逐步改变其生长条件使其组织发育完全，以适应外界环境。