U PLC同时测定脑安颗粒中6种人参皂苷类成分的含量

胡紫艳　孙夏荣　史达　朱颖　蒋健

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京210000）

U PLC同时测定脑安颗粒中6种人参皂苷类成分的含量

胡紫艳孙夏荣史达朱颖蒋健

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京210000）

目的：采用超高效液相色谱法（UPLC）分离测定脑安颗粒中 6种人参皂苷的含量。方法：采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，流速0.45 mL/min，检测波长203 nm，柱温35℃。结果：6种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rd分别在8.096～ 202.4，20.008～500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2和16.048～ 401.2 μg/mL与相应峰面积呈良好线性关系，平均加样回收率（n=6）分别为：98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%，98.10%，RSD分别为 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%，0.76%。结论：UPLC分离效果及重复性好，且快速简便，可作为脑安颗粒的质量控制方法。

超高效液相色谱；脑安颗粒；人参皂苷；含量测定

脑安颗粒由川芎、当归、红花、人参与冰片5味药组成。有活血化瘀、益气通络的功效，用于治疗脑血栓形成急性期、恢复期气虚血瘀[1]。临床应用证实脑安颗粒对血管性头痛的治疗效果较好，且不良反应少[2]；对老年神经衰弱也具有显著疗效[3-4]。目前标准采用的是薄层色谱法测定人参皂苷Re[1]，操作复杂且准确度不高，而对其他人参皂苷类成分没有规定。目前也尚未见同时测定脑安颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd这6种成分含量的报道。由于脑安颗粒成分复杂，若采用普通液相色谱法测定6种人参皂苷耗时较长，效率低下。超高效液相色谱（UPLC）技术的发展，为复杂体系中药的分离分析提供了良好的平台[5]。为提高脑安颗粒质量控制标准，进一步保证药物疗效，本研究采用UPLC技术，建立了同时测定脑安颗粒中人参皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd 6种成分的分离分析方法，此方法快捷、准确，重复性好，为脑安颗粒质量标准提供依据。

1　仪器、试剂与试药

1.1仪器

超高效液相色谱系统（ACQUITY UPLC，美国Waters公司）；天平XS 205（METTLER TOLEDO）；色谱柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

1.2试剂与试药

乙腈为色谱纯，水为超纯水；人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201530，含量91.7%）、人参皂苷Re对照品（批号：110754-201525，含量92.3%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201424，含量93.7%）、人参皂苷Rb2对照品（批号：110715-200802，含量94.8%）、人参皂苷Rb3对照品（批号：111686 -201002，含量 92.7%）、人参皂苷 Rd对照品（批号：111818-201001，含量94.4%），对照品均来源于中国食品药品检定研究院。脑安颗粒 （批号：20140610），河南省百泉制药有限公司生产。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为 Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；柱温 35℃；样品温度10℃；进样体积1 μL；流速0.45 mL/min；检测波长 203 nm；流动相 A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱程序见表1。在此条件下，6种人参皂苷分离度均大于1.5，对照品与样品UPLC色谱图见图1。

表1　脑安颗粒中6种皂苷类成分测定的梯度洗脱程序

图1　UPLC图

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取人参皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd对照品适量，精密称定，分别置于100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，使其浓度分别为1.012，2.501，2.014，1.030，2.006，2.058 mg/mL，作为对照品储备液 1～ 6。精密量取上述6个对照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成含人参皂苷 Rg1（40.48 μg/mL）、Re（100.04 μg/mL）、Rb1（80.56 μg/mL）、Rb2（41.20 μg/mL）、Rb3（80.24 μg/mL）、Rd（82.32 μg/mL）的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取约4 g，精密称定，加入甲醇 50 mL，超声提取 40 min，放冷，滤过，滤液蒸干，加水20 mL使溶解，用二氯甲烷洗涤2次，每次20 mL，弃去二氯甲烷液，水液用水饱和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤二次，每次 20 mL，弃去碱液层，用正丁醇饱和的水洗涤 2次，每次20 mL，再将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，并转移至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察精密量取对照品溶液0.20，0.30，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 μL，分别进样，测定峰面积。分别以各色谱峰面积（Y）对其浓度（X）进行线性回归，得回归方程，结果见表 2。

表2　6种人参皂苷的回归方程

2.3.2精密度试验精密吸取对照品溶液 1 μL，重复进样5次。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Rb2、人参皂苷 Rb3和人参皂苷Rd峰面积的RSD分别为0.52%，0.91%，0.45%，0.63%，0.52%和0.92%（n=5），表明本试验方法的精密度良好。

2.3.3溶液稳定性试验精密吸取同一供试品溶液 （批号：151106）1 μL，分别于0，2，8，12，24 h进样，测定峰面积。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd峰面积的RSD分别为0.60%，0.71%和0.93%，0.97%，0.54%和1.02%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4重复性试验取同一批样品（批号：151106）适量，共5份，按“2.2.2”项下方法制备，每份测定3次。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd的平均含量分别为每袋0.19，0.34，0.17，0.15，0.27，0.34 mg，RSD分别为1.12%，1.03%，0.80%，0.43，0.59%和0.66%，表明本法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验取已知含量的样品（批号：151106）适量，研细，精密称取4 g，分别精密加入人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3　加样回收率试验结果

2.4样品测定的结果

取3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批制备3份，每份测定2次，取两份的平均值，见表4。

表4　样品测定结果　（mg/袋）

3　讨论

3.1人参总皂苷纯化方法的选择

脑安颗粒为多组分组成的中成药，成分复杂，若提取不完全杂质较多，影响人参皂苷的测定。因此采用溶剂萃取法对人参皂苷进行纯化，除去大部分杂质。参考文献[6-8]，先用甲醇超声提取，与原标准[1]中的索氏提取相比时间缩短、收率提高、温度降低；用二氯甲烷去除大部分杂质；再用水饱和正丁醇萃取样品中人参皂苷，最后用正丁醇饱和水去除样品中过量的杂质。文献[9-10]报道采用D-101大孔吸附树脂进行纯化，虽效果较好，但需对大孔树脂进行预处理、装柱、洗柱等步骤，方法繁琐、耗时；而溶剂萃取法相对简便、用时少，通过上述萃取方法可去除大部分杂质。所以，本实验采用溶剂萃取法对人参中的人参皂苷进行分离纯化。

3.2洗脱梯度的选择

本实验建立了同时测定脑安颗粒中6种人参皂苷含量的方法，参照文献[11-15]报道，通过探索不同的洗脱体系，不同的梯度洗脱程序，最终得到了优化洗脱系统，使 6种重要的人参皂苷类成分获得完全的分离。选用乙腈-水梯度洗脱，其中，0～ 9 min时，乙腈占18～ 22，在18～ 26 min之间，乙腈占52～ 18，可使样品中人参皂苷 Rg1与人参皂苷Re、人参皂苷Rb2与人参皂苷Rb3的分离度最佳（R≥1.5），该色谱条件可用于6种人参皂苷的含量测定。用超高效液相色谱法同时测定脑安颗粒中6种人参皂苷，改进了原标准中的含量测定方法，该方法更加准确、快速、可靠，同时增加了脑安颗粒的检测项目，可作为脑安颗粒的质量控制方法。

本实验采用UPLC同时测定了脑安颗粒中6种人参皂苷类成分，增加了原标准对人参的检测指标，又改进了原标准的方法，且该方法更加准确、快速、可靠。

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Simultaneous Determination of Contents Six Kinds of Ginsenosides in Naoan Granules by UPLC

Hu Ziyan，Sun Xiarong，Shi Da，Zhu Ying，Jiang Jian（1 Nanjing Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Nanjing 210000，China）

Objective：To develop a ultra performance liquid chromatography（UPLC）method for simultaneous determination of contents of six kinds of ginsenosides in Naoan granules.Methods：ACQUITY BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）was used with a mobile phase consisting of acetonitrile（A）-water（B）by gradient elution at a flow rate of 0.45 mL/min.The wavelength for detection was 203 nm while the column temperature was 35℃.Results：The contents of ginsenosides Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rb3and Rd within the range of 8.096～ 202.4，20.008～ 500.2，16.112～ 402.8，8.24～ 206，16.048～ 401.2 and 16.048～ 401.2 μg/mL showed good linear relationship to the corresponding peak areas，respectively.The average recoveries of the six kinds of ginsenosides were 98.92%，98.78%，97.91%，98.00%，98.13%and 98.10%，with RSDs of 0.46%，0.43%，0.26%，0.70%，0.62%and 0.76%，respectively.Conclusion：The UPLC method showed good separation effect and reproducibility，which was rapid，simple，and might be used for the quality control of naoan granules.

Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）；Naoan Granules；Ginsenoside；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.12.006

胡紫艳，女，硕士，主管药师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：huzy0903@163.com

（2016-09-29）