心脏内膜是苯并芘与α-萘黄酮的毒性靶点？

杨景峰，王丰，于华荣，于永利，魏素香，赵宝全，董武,*

1. 内蒙古民族大学动物科技学院/内蒙古自治区高等学校毒物与动物疾病监控重点实验室，通辽 028000 2. 内蒙古民族大学农学院，通辽 028000 3. 内蒙古民族大学生命科学院，通辽028000 4. 路易斯维尔百奥生生物科技公司，美国德克萨斯州 5. 军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850



心脏内膜是苯并芘与α-萘黄酮的毒性靶点？

杨景峰1，王丰1，于华荣2，于永利3，魏素香4，赵宝全5，董武1,*

1. 内蒙古民族大学动物科技学院/内蒙古自治区高等学校毒物与动物疾病监控重点实验室，通辽 028000 2. 内蒙古民族大学农学院，通辽 028000 3. 内蒙古民族大学生命科学院，通辽028000 4. 路易斯维尔百奥生生物科技公司，美国德克萨斯州 5. 军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850

苯并芘(benzo-a-pyrene, BaP)是一种典型的致癌物质，具有一定的心血管毒性。试验在形态学观察的基础上，检测了细胞色素P450(CYP1A)在心脏的表达。结果表明虽然α-萘黄酮(ANF)没有诱导，但BaP和BaP+ANF强烈诱导CYP1A的基因表达，以及在心脏内膜有强烈的蛋白质表达，在BaP与ANF同时染毒引起心脏水肿。说明心脏是BaP以及ANF的目标组织，进一步说明鱼胚胎在药物以及环境物质评价中的优势。

BaP；胚胎；心脏；毒性

苯并芘(benzo-a-pyrene, BaP)和卤代芳族烃如2,3,7,8-四氯-二苯-对-二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)等多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)广泛存在环境中，其对有机体的生殖、发育和心血管均有一定的影响[1]。在美国，多环芳香烃的混合物(#7)，芘(#9)和benzo(b)fluroanthene(#10)等有害物质在环境法的优先级列表中(http://www.atsdr.cdc.gov/cercla/05list.html)。而相比之下卤代烃，如多氯联苯和有机氯农药，在美国沉积物中有表明下降趋势，但PAHs的浓度一直呈上升趋势，尤其是城镇附近的土地中[1]。α-萘黄酮(α-naphthoflavone, ANF)是一种实验室常用的多环芳烃衍生物，作为部分AHR拮抗剂和CYP1A抑制剂。

有关BaP的毒性机理，被认为是经由芳香烃受体(AHR)介导，通过诱导CYP1A酶，代谢BaP而成为致突变和致癌代谢物[2-3]，最终表现为致癌作用。近年来多环芳烃也被认为是内分泌干扰物(endocrine disrupting compounds, EDCs)，具有降低有机体的繁殖能力的不良影响。体内和体外PAH染毒可导致排卵量、卵巢体细胞指数、17β-雌二醇水平以及卵黄原蛋白等指标的减少[4]。鳉鱼(Fundulus heteroclitus)作为“首要的硬骨模型”在环境生物学中受到非常的重视[5]。鳉鱼主要分布在河口，大西洋海岸线沿岸，它们保持着非常小的活动范围[6]，在生殖和发育生物学已经得到认可[7-8]。鳉鱼被广泛地用于实验室研究，用于进一步了解环境毒物的分子机制，包括但不仅限于多环芳烃[9-13]。

本研究以鳉鱼为模型动物，给早期鳉鱼胚胎染毒，探讨BaP、ANF以及两者合并染毒的形态学变化，及其毒性作用机理。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 药物

苯并芘(benzo[a]pyren, BaP, 纯度99%, 100 μg·L-1, 400 nmol·L-1溶于酒精中)，α-萘黄酮(alpha-naphthoflavone, ANF, 纯度99%)，二甲基亚砜(纯度>99.5%, DMSO)溶液等其他药物均来源于Sigma公司(Sigma, St Louis, MO)。

1.2 试验动物及染毒方式

鳉鱼(Fundulus heteroclitus)饲养于玻璃容器中，水温20 ℃，光照周期为14 h·d-1，受精后4.5 h，挑出发育正常的受精卵，放在10 mL的玻璃瓶中染毒。染毒浓度分别为：DMSO对照(0.1%，1 μg·L-1)，BaP (100 μg·L-1)，ANF (100 μg·L-1)和BaP (100 μg·L-1) + ANF (100 μg·L-1)，每种暴露浓度中含有5～10粒胚胎，每组进行3次平行实验。暴露开始后，将鳉鱼胚胎移入20 ℃孵化箱进行培养。各染毒组染毒48 h后更新染毒液，培养至实验所需的发育时间，用于免疫组化、定量PCR(RT-PCR)和形态学观察。

1.3 抗原-抗体反应

使用4%的中性缓冲多聚甲醛(PFA)将鱼胚胎于4 ℃环境中固定24 h后进行常规石蜡包埋、切片、脱脂、梯度酒精脱水(100% I, 100% II, 95%, 90%, 80%和70%各2 min)，再经5～10 min流水清洗后，用10 mg·L-1蛋白酶K消化15 min，使用1%血清/PBTR(含1%Trito X-100的PBS)30 min封闭处理后与小鼠抗CYP1A单克隆抗体，在4 ℃环境中反应过夜。用缓冲液(PBTR)清洗后，滴加二抗(抗小鼠IgG抗体)放置在室温反应2 h。用ABC KIT (Vectar Lab)发色，再使用甲基绿(methyl Green)进行相应的对比染色。

1.4 RNA的提取纯化以及定量PCR(RT-PCR)技术

总RNA的制备将使用Trizol(Gibco产品)，使用手动或者匀浆仪打碎鱼胚胎后者脏器后，加入氯仿并且离心，使之分为水相和有机相两层。用移液枪转移水相 (内含有RNA)，用异丙醇沉淀RNA，经80%乙醇洗涤2遍后用水(RNase free)溶解。制备好的RNA样品用核酸定量分析仪检测OD260、OD260/OD280的值，并计算RNA产量。根据不同需要，进行RNA的提纯工作。转录使用反转录酶2 μL，5x Buffer 4 μL，5 mmoL·L-1dNTP加4 μL，反转录抑制剂1 μL，10X RT下游引物2 μL，模板5 μL，最后加DEPC水至20 μL。42 ℃、60 min后，在冰水中冷却2 min备用。Sybr GreenI RT-PCR方法的建立：在25 μL，反应体系中，加入sybr GreenI PCR反应混合液12.5 μL，CYP1A上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL (1 ng)，水9.5 μL。在95 ℃、10 min，然后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min条件下反应40个循环。内参基因以及计算使用18 s，计算采用2-△△CT方法来计算基因表达的相对变化。

图1 BaP和/或ANF(α-萘黄酮)对早期胚胎心脏的影响 注：鳉鱼胚胎从4.5 hpf开始分别使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至10 dfp，观察检测心脏变化，箭头表示心脏。Fig. 1 BaP and/or ANF (alpha naphthyl flavonoids) changed heart malphomation in fundulus embryosNote: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 10 dpf, observed heart malphomation. Arrow indicates heart.

1.5 数据统计与分析

试验数据用SPSS统计软件进行单因素方差分析方法进行多重比较，用平均值 ± 标准误差表示，差异显著性水平设置为 P<0.05。

2 结果(Results)

2.1 形态学的影响

许多环芳香烃(PAH)，如苯并芘(BaP)，是已知的致癌物质，最近也发现其具有严重的发育毒物。当使用BaP与α-萘黄酮(ANF)组合给鳉鱼胚胎染毒时，引起鳉鱼胚胎严重的心脏毒性，如血液凝块、心包水肿和线状心脏等。以往ANF作为CYP1A的竞争性抑制剂，用以减少BaP的毒性，但本实验发现BaP与ANF联合染毒诱导CYP1A基因表达以及蛋白质表达，诱导心脏细胞凋亡和心脏毒性。

试验使用10 μg·L-1ANF、100 μg·L-1BaP以及10 μg·L-1ANF + 100 μg·L-1BaP染毒至10 dfp，结果表明对照组和ANF组没有明显的变化，虽然BaP组没有明显的变化，但是BaP+ANF染毒组出现严重的心囊水肿，心脏出现线条状，呈绷紧状态(图1D和E)，通过ImageJ软件分析心脏大小，发现BaP+ANF组心脏面积显著变小(图2)。

图2 量化BaP和/或ANF对早期胚胎心脏面积的影响 注：鳉鱼胚胎从4.5 hpf开始分别使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至10 dfp，测量心脏面积，n=10,不同数字间表示差异极显著，P<0.05。Fig. 2 Quantitafication of the effect of BaP and/or ANF on heart area at embryo early stage Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 10 hpf, and observed heart area. Different letter indicate significant difference, P<0.05.

图3 BaP和/或ANF对CYP1A基因表达的影响 注：鳉鱼胚胎从4.5 hpf开始分别使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒，至48 hpf和120 hpf收集提取RNA用于RT-PCR检测。n=3 (每组10个鱼卵)。Fig. 3 BaP and/or ANF affect CYP1A mRNA expression Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 48 hpf and 120 hpf, collect total RNA and carry out RT-PCR. n=3 (10 eggs/group).

图4 BaP和/或ANF对早期胚胎心内膜CYP1A蛋白质表达的影响 注：鳉鱼胚胎从4 hpf开始分别使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至120 hpf，实施固定、切片以及免疫染色。n=5，箭头表示阳性反应的心脏内膜，** 心脏外膜。Fig. 4 BaP and/or ANF affect CYP1A protein expression in inner membrane at early stage embryos Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 120 hpf , carry out fix, sectioning and immunohistochemistry staining. n=5, arrow indicated inner membrane of heart and ** indicated out membrane of heart.

2.2 CYP1A表达的变化

实验使用10 μg·L-1ANF、100 μg·L-1BaP以及10 μg·L-1ANF + 100 μg·L-1BaP给鳉鱼染毒至48 hpf和120 hpf，收集鱼卵提取整体RNA，之后转录为cDNA，使用18s作为看家基因进行对比，发现Bap在48 hpf诱导提高了214倍(图3)。在120 hpf BaP诱导量进一步提升到452倍。BaP+ANF组在48 hpf高达1 585倍，但在120 hpf没有48 hpf的高诱导量，但也达到693倍(P<0.05)(图3)。至120 hpf，使用福尔马林固定各组，进行脱水、包埋、切片，然手实施CYP1A免疫组织染色，结果表明在对照组和ANF染毒组，在心脏几乎没有阳性CYP1A反应，但在BaP染毒组可以清晰看到心脏内膜的褐色阳性反应，没有在外膜发现(图4C)，在BaP+ANF染毒组，CYP1A阳性反应表达不但在心脏内膜，在心脏外膜也同样被发现(图4D)。

3 讨论(Discussion)

BaP是一种典型的PAHs化合物，有关“心脏是BaP的毒性靶器官”，在小鼠和大鼠实验中没有查到相关报道，但在鱼类有类似的报道。如Gerger等[14]报道BaP给成年斑马鱼染毒后，发现心肌组织CYP1A mRNA表达显著高于对照组，同时也高于在肝脏和骨骼肌内的表达，但没有关于CYPA1A蛋白质水平的表达的报道。使用BaP给初期斑马鱼胚胎染毒，Incardona等[15]的报道与我们相似，不但BaP诱导幼鱼形态学变化，也在基因水平强烈诱导CYP1A mRNA表达。在蛋白质水平，我们使用切片技术确认BaP诱导幼鱼心脏内膜表达是首次报道。在本试验中，进一步验证BaP是一种强大CYP1A诱导剂。α-萘黄酮(α-naphthoflavone, ANF)本身虽然不能够诱导CYP1A和毒性症候群，但当BaP与ANF一同染毒时，并没有文献[16]报道那样抑制CYP1A的诱导，反而极度显著的在基因水平和蛋白质水平增加CYP1A，同时在形态学上表现为极度的心囊水肿。不同环数PAHs化合物对海水青鳉胚胎发育的毒性作用方式可能不同，但通过ANF抑制CYP1A诱导可分别导致Phe、Py和BaP对海水青鳉胚胎发育的毒性升高，二者呈潜在的协同作用徐增光等[17]报道小鼠染毒苯并(a)芘(BaP)9周过后，小鼠肺组织的CYP1A表达增加，但是随着BaP剂量继续增加，CYP1A表达量反而呈降低趋势，表明低剂量BaP染毒诱导小鼠肺组织CYP1A mRNA表达，高剂量的BaP染毒则抑制CYP1A mRNA的表达，既在48 hpf出现BaP诱导的高表达CYP1A，但经连续染毒到120 hpf时候，CYP1A mRNA表达量反而比48 hpf低很多(图3)。

在ANF的影响下，Phe、Py和BaP对EROD的诱导均不同程度的被抑制，但三者对胚胎的发育毒性却均被提升，这果表明ANF与PAHs类化合物的联合暴露并不是简单的相加作用，而是具有潜在的协同作用，其毒性机制也较为复杂，并不完全符合DLCs作用方式；在实际环境中，部分PAHs化合物对CYP1A活性具有抑制性，表现为一种非竞争性的抑制剂(如荧蒽)。因此，本文部分证实了现有PHAs混合物毒性评价方法可能低估了实际环境中PAHs混合物毒性风险的结论。

通过本试验表明，心脏是BaP的毒性靶器官，预示鳉鱼作为实验动物模型来检测环境污染物质的可能性，高通量判断环境污染程度具有重要意义。

[1] Van Metre P C, Mahler B J. PAH concentrations in lake sediment decline following ban on coal-tar-based pavement sealants in Austin, Texas [J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(13): 7222-7228

[2] Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) [R]. Atlanta, Georgia: ATSDR, 1995

[3] Piskorska-Pliszczynsk J, Keys B, Safe S. The cytosolic receptor binding affinities and AHH induction potencies of 29 polynuclear aromatic hydrocarbons [J]. Toxicology Letters, 1986, 34: 67-74

[4] Hoffman J L, Oris J T. Altered gene expression: A mechanism for reproductive toxicity in zebrafish exposed to benzo[a]pyrene [J]. Aquatic Toxicology, 2006, 78: 332-340

[5] Burnett K G, Bain L J, Baldwin W S, et al. Fundulus as the premier teleost model in environmental biology: Opportunities for new insights using genomics [J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics Proteomics, 2007, 2: 257-286

[6] Lotrich V A. Summer home range and movements of Fundulus heteroclitus (Pisces: Cyprinodontidae) in a tidal creek [J]. Ecology, 1975, 56: 191-198

[7] Taylor M H. A suite of adaptations for intertidal spawning [J]. American Zoologist, 1999, 39: 313-320

[8] Armstrong P B, Child J S. Stages in the normal development of Fundulus heteroclitus [J]. Biology Bulletin, 1965, 128: 143-169

[9] Wassenberg D M, Di Giulio R T. Synergistic embryotoxicity of polycyclic aromatic hydrocarbon aryl hydrocarbon receptor agonists with cytochrome P4501A inhibitors in Fundulus heteroclitus [J]. Environmental Health Perspectives, 2004, 112: 1658-1664

[10] Meye J N, Wassenberg D M, Karchner S I, et al. Expression and inducibility of aryl hydrocarbon receptor pathway genes in wild-caught killifish (Fundulus heteroclitus) with different contaminant-exposure histories [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2003, 22: 2337-2343

[11] Willett K, Steinberg M A, Thomsen J, et al. Exposure of killifish to benzo(a)pyrene: Comparative metabolism, DNA adduct formation and aryl hydrocarbon (Ah) receptor agonist activities [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B: Biochemistry & Molecular Biology, 1995, 112B: 93-103

[12] Wang L, Scheffler B E, Willett K L. CYP1C1 messenger RNA expression is inducible by benzo[a]pyrene in Fundulus heteroclitus embryos and adults [J]. Toxicological Sciences, 2006, 93: 331-340

[13] Stine C B, Smith D L, Vogelbein W K, et al. Morphometry of hepatic neoplasms and altered foci in the mummichog, Fundulus heteroclitus [J]. Toxicologic Pathology, 2004, 32: 375-383

[14] Gerger C J, Weber L P. Comparison of the acute effects of benzo-a-pyrene on adult zebrafish (Danio rerio) cardiorespiratory function following intraperitoneal injection versus aqueous exposure [J]. Aquatic Toxicology, 2015, 165: 19-30

[15] Incardona J P, Linbo T L, Scholz N L. Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development [J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2011, 257(2): 242-249

[16] Mu J L, Wang X H, Jin F, et al. The role of cytochrome P4501A activity inhibition in three- to five-ringed polycyclic aromatic hydrocarbons embryotoxicity of marine medaka (Oryzias melastigma) [J]. Marine Pollution Bulletin, 2012, 64(7): 1445-1451

[17] 徐增光, 文冠华, 高雅娟, 等. 苯并(a)芘对小鼠肺组织细胞色P450 1A表达的影响[J]. 华中科技大学学报: 医学版, 2005, 34(4): 401-406

Xu Z G, Wen G H, Gao Y J, et al. Effect of benzo (a) pyrene on the CYP1A expression of lung tissue in mice [J]. Acta Medicine Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong, 2005, 34(4): 401-406 (in Chinese)

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Heart is the Target Organ of BaP and Alpha Naphthyl Flavonoids？

Yang Jingfeng1, Wang Feng1, Yu Huarong2, Yu Yongli3, Wei Suxiang4, Zhao Baoquan5, Dong Wu1,*

1. Inner Mongolia Provincial Key Laboratory for Toxicants and Animal Disease, College of Animal Science and Technology, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 2. College of Agriculture Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 3. School of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 4. Bio-Synthesis, Inc.-DNA Lab Department, Lewisville, TX, USA 5. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China

Received 25 September 2015 accepted 11 November 2015

Benzo-a-pyrene (BaP) is a typical carcinogen, and has cardiovascular toxicity. We focused on heart morphological changes, cytochrome P4501A mRNA (CYP1A) expression and protein expression. In the heart, although the results showed that α-naphthoflavone (ANF) did not induce the expression of CYP1A mRNA, but CYP1A mRNA was strongly induced by BaP and BaP + ANF treatment, and CYP1A protein expression was also strongly induced in the inner membranes of heart. The results indicate that the heart is a target tissue of BaP and ANF, further illustrating the advantages of fish embryos for the evaluation of drugs and environmental substances.

BaP; embryos; heart; toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20150925001

国家自然科学基金(Nos. 21267015，81360508，21567019)；内蒙古自治区自然科学基金(Nos. 2012MS1203，2015MS0804)；草原英才工程项目(2015-2016)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY11202)；内蒙古民族大学科学研究基金资助项目(NMDGP1505)；内蒙古自治区科技创新引导项目(2015-2016)；人才开发基金项目(2014-2015)

杨景峰(1974-)，男，副教授，博士，研究方向为鱼类生物技术，Email: yangjf@188.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: dongwu2002@hotmail.com

2015-09-25 录用日期：2015-11-11

1673-5897(2016)2-394-05

X171.5

A

简介：董武(1969—)，男，博士，硕导，主要从事环境毒理学研究，发表学术论文50余篇。

杨景峰, 王丰, 于华荣, 等. 心脏内膜是苯并芘与α-萘黄酮的毒性靶点？[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 394-398

Yang J F, Wang F, Yu H R, et al. Heart is the target organ of BaP and alpha naphthyl flavonoids？ [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 394-398 (in Chinese)