降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及与中药协同作用的研究

董 浩，王红丽，王 莘

(吉林农业大学 生命科学学院，长春 130118)



降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及与中药协同作用的研究

董 浩，王红丽，王 莘

(吉林农业大学 生命科学学院，长春 130118)

为了获取高效降胆固醇菌种，研究中药与乳酸菌是否具有协同降胆固醇的作用，采用以酸菜汁为实验材料，利用碳酸钙平板透明圈法以及传统食品泡菜中降胆固醇乳酸菌的筛选方法筛选出降胆固醇的乳酸菌。然后鉴定高效降胆固醇菌株的种属。用该菌株与五味子水煎液的混合物灌胃小鼠。结果显示：所分离的乳酸菌大都有一定的降胆固醇能力，其中有1株菌对培养基中胆固醇的降解率为86.96%，经鉴定为鼠李糖乳杆菌。该菌与中药五味子水煎液的混合物能显著降低高血脂小鼠血浆中的TC、TG、LDL-C水平，且无明显的毒副作用。因此得出结论：筛选出1株高效降胆固醇乳酸菌，该乳酸菌与五味子水煎液的混合物有显著的降胆固醇作用。

中药；降胆固醇；乳酸菌

目前我国约有1.6亿人患有血脂异常[1]。通常来说，血脂主要是由甘油三酯及胆固醇组成[2]。国外大量研究表明，乳酸菌能够减少胆固醇含量[3-5]。通过多年对乳酸菌降胆固醇的研究，已有许多能够降胆固醇的菌种被人们发现，并应用于生活中。也有专家学者研究了中药降胆固醇的效果。本实验着重比较研究乳酸菌、中药及二者协同降高血脂症小鼠胆固醇效果。

1 材料

1.1 实验材料

实验用的酸菜汁样品由超市购买。普通级昆明小鼠(雄性)70只，4周龄，体质量(18±3)g。

1.2 培养基

MRS固体、液体培养基[6]；MRS-碳酸钙培养基[7]；MRS胆固醇培养基[8]。

1.3 试剂

牛胆盐，北京市海淀区微生物培养基制品厂；胆固醇，北京爱普华美生物科技有限公司；血清总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒 南京建成生物工程有限公司；硫酸铁铵、无水乙醇等均为分析纯。

1.4 实验仪器与设备

YXQ-LS-50 SⅡ高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DH5000A型电热恒温培养箱，中国天津市泰斯特仪器有限公司；TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；Spectrophotometer可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司制造。

2 方法

2.1 降胆固醇乳酸菌的筛选

降胆固醇乳酸菌的筛选方法参见文献[9]。选取菌落为乳白色、湿润、圆形的菌株在平板上反复划线分离、纯化，得纯菌株后于甘油管中-20℃保存[9-10]，留做后续研究。将保留的各菌株平板划线培养110h30min,选取其中具有明显溶钙圈的菌落，利用数显千分尺测量菌落直径及透明圈直径。

2.2 胆固醇降解率的测定

胆固醇降解率的测定采用铁矾显色法，具体操作详见文献[9,11-14]。

2.3 高效降胆固醇乳酸菌的鉴定

通过常规细菌鉴定方法鉴定胆固醇降解率最高的菌株的种属。

2.4 系统发育树的构建

以GeneBank中相似度超过99%的序列做对比，运用MEGA5.10软件构建分子进化树。

2.5 乳杆菌及中药体内降胆固醇实验

2.5.1 灌胃液的制备

灌胃菌液的制备参见参考文献[15]。沉淀的菌体用0.9%的生理盐水悬浮，将菌液稀释至所需浓度(高剂量2×1010CFU/mL,中等剂量2×108CFU/mL，低剂量2×106CFU/mL)。

本实验之所以选用五味子是比较了10味应用最多的单味中药体外胆固醇降解率才选定胆固醇降解率最高的五味子来灌胃小鼠。中药五味子灌胃液的制备：40g中药→450mL自来水浸泡1h→大火煮开→改文火煮25min→4层纱布过滤→依此方法进行2次→将两次所得混合。

中药与乳酸菌复合液所采用的配比是通过比较1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2:1这几个配比下的胆固醇降解率才选定中药与乳酸菌的配比为3∶2。

每次每只灌胃0.4mL。

2.5.2 高脂饲料的制备

高脂饲料含基础饲料88.8%、猪油10%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%[16]。先按比例称取胆固醇、胆盐并将二者充分混匀，再与称取的猪油搅拌均匀。称取相应比例的基础饲料，把前三者的混合物与基础饲料一起搅拌，使其均匀的分布在基础饲料的表面[17]。

2.5.3 动物分组及实验方案

普通饲料适应性饲养3d后,随机分为7组,每组10只，连续饲喂不同的饲料4周(具体的分组及饲喂方式见表1)。在实验的第0、2、4周分别割尾采血(采血前禁食12h，不禁水)，离心分离血浆。每天保证充足的食物和饮水，更换垫料，自由饮水，按照表1中方案，每天上午固定时间对小鼠进行灌胃，并保持饲养房的通风、透光和清洁卫生[18]。第28天采血后，昆明小鼠断颈处死，解剖后分别取心、肝、脾、肾称重[19]。

表1 实验分组情况

2.5.4 检测指标及方法

按照试剂盒说明书的要求测定血浆中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量。

2.5.5 数据处理

所有数据经SPSS13.0统计软件进行方差分析，处理后用x±s表示，采用Duncan法进行显著性检验，P>0.05表示无显著性差异，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示差异非常显著[20]。

3 结果和分析

3.1 降胆固醇乳酸菌的透明圈大小

选取了菌落为乳白色、湿润、圆形的83株菌株进行后续研究。其中71株菌株的溶钙圈尤其明显。部分菌株的菌落直径与透明圈直径之由小到大排列，如表2所示。

表2 菌株的透明圈

3.2 胆固醇的降解率

实验菌株在胆固醇培养基中大都有一定的降解胆固醇的效用(所测试的83株乳酸菌中有79株在培养基中具有脱除胆固醇的能力)但是，各菌株在胆固醇培养基中胆固醇降解率差别较大，脱除率从1.35%～86.96%不等。其中降胆固醇效果最好的菌株为H4，其胆固醇降解率达到86.96%。部分菌株在胆固醇培养基中的胆固醇降解率由高到低排列，如表3所示。

表3 菌株的胆固醇降解率

3.3 鉴定结果

经鉴定H4菌株为鼠李糖乳杆菌。图1所示为菌株H4的扫描电镜图。

图1 菌株H4的扫描电镜图

3.4 H4的系统发育树

菌株H4的系统发育树如图2。

图2 菌株H4基因进化树

3.5 小鼠高脂模型的建立结果

饲喂普通饲料小鼠与饲喂高脂饲料小鼠血脂变化如表4。

表4 饲喂普通饲料小鼠与饲喂高脂饲料小鼠血脂变化(x±s,n=10)

由表4可见，普通组小鼠血浆TC、TG、HDL-C及LDL-C的浓度一直保持稳定(P>0.05)。高脂组在饲喂高脂饲料14d后，血浆TC、TG、HDL-C浓度与普通组相比差异不显著(P>0.05)，但LDL-C浓度与普通组相比差异极其显著(P<0.01)，高脂组在饲喂高脂饲料28d后，血浆HDL-C浓度与普通组相比差异不显著(P>0.05)，但TC、TG、HDL-C 浓度与普通组相比明显升高，两者差异极其显著(P<0.01)，表明造模成功。

3.6 菌株H4对高脂血症小鼠血脂的影响

整个实验期间，各组小鼠毛色光洁，食欲正常，未出现异常体征，未发生自然死亡[21]。

表5 H4对小鼠血脂的影响(x±s,n=10)

由表5可知，经过28天灌胃后，与高脂组相比，H4高剂量组，中剂量组及复配组的血浆TC、TG以及LDL-C含量存在极其显著的差别。但各组对血浆HDL-C的作用不明显(P>0.05)。对比表7中各组数据发现复配组对小鼠降胆固醇作用比中药及乳酸菌单独作用效果都要好。

3.8 对高脂血症小鼠脏器指数的影响

小鼠肝、心、脾及肾与体质量的百分比如表6所示。

表6 小鼠的脏器指数(x±s,n=10)

由表6可见，各组间肝脏和体质量比未有显著性差异(P>0.05)，这表明实验期间小鼠灌胃H4及中药等未见明显的毒副作用。

4 结论与讨论

本研究对酸菜汁中降解胆固醇的菌株进行了比较研究，得出了一些较为明确的结果，发现酸菜汁中分离的乳酸菌都有一定的降胆固醇能力。其中一菌株H4降胆固醇效果优良，是非常具有开发潜力的微生物资源，可以成为工业菌种驯化的材料。比在菠菜[22]中筛选到的降胆固醇乳酸菌的降解率(4.82%)要高，比在浆水[23]中筛选到的降胆固醇乳酸菌的降解率(92.28%)略低。通过对比表2和表3中菌株可知：透明圈明显的菌株(有胆盐水解酶的菌株)不一定具有降胆固醇的能力或者具有胆固醇降解率但却不能很好的去除胆固醇；相反，有降解胆固醇能力的菌株不一定有胆盐水解酶。用H4灌胃昆明小鼠实验结果表明，H4能显著降低血清TC、TG和LDL-C的浓度，而各组间血清HDL-C的含量差异不显著，说明HDL-C值不易受外界因素的影响而发生变化。对比表5中H4高、中、低剂量组数据可以发现，菌株H4具有降低体内胆固醇的作用，且作用效果与其浓度相关。对比表6中各组数据发现复配组对小鼠降胆固醇作用比中药及乳酸菌各自单独作用效果都要好。

综上所述，乳杆菌H4与中药五味子具有良好的协同降胆固醇功效，而且安全可靠，在开发降血清胆固醇功能性制品方面具有广阔的市场前景。

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责任编辑：程艳艳

Study on Screening and Identification of Cholesterol-reducing Lactic Acid Bacteria and Its Synergistic Effect with Traditional Chinese Medicine

DONG Hao, WANG Hongli, WANG Xin

(School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In order to get efficient cholesterol-reducing strains and study whether traditional Chinese medicine and lactic acid bacteria have synergistic effects on cholesterol reduction, in this paper, by taking sauerkraut juice as an experimental material, the cholesterol-reducing lactic acid bacteria is screened with the method of calcium carbonate clarity circle on plate and the method of screening lactic acid bacteria from traditional pickles. The species of the efficient cholesterol-reducing strains is identified. The mixture of this strain and schisandra fruit decoction is used to feed mice. The results show that almost all lactic acid bacteria isolated have certain cholesterol-reducing effects, the cholesterol degradation rate of one of them is 86.96%, which is identified as Lactobacillus rhamnosus. The mixture of this strain and schisandra fruit decoction can significantly reduce the levels of TC, TG and LDL-C in plasma of mice with hyperlipidemia. So we come to a conclusion that one of efficient cholesterol-reducing lactic acid bacteria is screened, the mixture of this strain and schisandra fruit decoction has significant effects on cholesterol reduction.

traditional Chinese medicine; cholesterol-reducing; lactic acid bacteria

2016-06-18

长春市科技局项目(2012223)

董浩(1979-)，男，吉林公主岭人，副教授，博士，主要从事动物病毒学方向的研究；王红丽(1986-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，主要从事微生物资源开发与利用方面研究。

Q93.331

A

1009-3907(2016)10-0053-06