精氨酸剥夺治疗在肝细胞癌中的研究进展

陈洁 曾庆磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江



·综 述·

精氨酸剥夺治疗在肝细胞癌中的研究进展

陈洁 曾庆磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江

肝细胞癌是全球第六常见的恶性肿瘤，占恶性肿瘤死因的第三位[1]。据统计：中国每年新患肝癌人数为46.61万，每年死亡人数为42.21万[2]。肝癌的主要病因有病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉素、化学致癌物和环境因素等[1]。治疗方法主要是肝切除术、经导管动脉化疗栓塞、射频消融术(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)和肝移植。索拉非尼是晚期肝癌患者全身化疗的一线用药，只能延长患者生存时间3个月左右。

随着肿瘤分子生物学研究的深入，发现肿瘤有其特殊的生理学特性。譬如，精氨酸是半必需氨基酸，正常细胞可摄取外源性精氨酸，也可从头合成精氨酸。一些肿瘤，特别是肝细胞癌，精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)是缺陷的，使得精氨酸代谢障碍，而完全依赖于外源性精氨酸来支持必需的生物过程，即精氨酸营养缺陷型。研究发现精氨酸剥夺治疗在肝癌中有一定效果，本文就精氨酸剥夺治疗在肝细胞癌中的研究进展进行如下综述。

一、精氨酸的生物化学及在肿瘤中的作用

精氨酸是尿素循环中鸟氨酸的上游产物。经鸟氨酸氨甲酰氨基转移酶(OTC)催化，鸟氨酸转化为瓜氨酸。瓜氨酸由ASS1和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)催化而生成精氨酸。精氨酸酶水解精氨酸为鸟氨酸和尿素，鸟氨酸再次进入尿素循环。精氨酸也可在一氧化氮合酶催化下产生一氧化氮(NO)和瓜氨酸，还可由鸟氨酸生成多胺类(图1)。

精氨酸参与多种细胞代谢过程，可促进伤口愈合，促进多种激素释放，并有免疫调节活性等。1930年，ESM1R等发现了精氨酸促进肿瘤生长的作用。无论对于原发还是种植产生肿瘤的小鼠，精氨酸喂养都促进其肿瘤生长[3]。同时，精氨酸是多胺类的前体，这被证明促进了肿瘤的生长、转移、侵袭[4]。另外，精氨酸是NO的唯一底物，NO可通过血管内皮生长因子促进肿瘤血管生成，并可调控肿瘤细胞DNA的破坏及修复，还可通过caveolin-1来调控肿瘤细胞侵袭行为等[5]。

注：①OTC；②ASS1；③ASL；④精氨酸酶。Ⅰ氨基甲酰磷酸合成酶2；Ⅱ门冬氨酸氨基甲酰转移酶；Ⅲ二氢乳清酸酶。

图1 尿素循环和嘧啶从头合成的关系及精氨酸剥夺治疗途径

注：[1]未提供，[2]阳性相关，[3]阴性不相关

二、ASS1在肿瘤中的重要作用

肝癌中缺乏ASS1[6](表1)。ASS1缺失由ASS1基因启动子甲基化造成，并被认为促进了肿瘤增殖、侵袭、迁移[11][15]。例如检测149位乳腺癌患者肿瘤组织中ASS1表达情况时发现，ASS1阴性占63.8%(95/149)[16]。用shASS1敲除ASS1基因则促进了乳腺癌细胞增殖和侵袭[16]。体外实验重新引入ASS1抑制了肿瘤血管生成、肿瘤增殖和迁移，表明ASS1可能是一种新型的肿瘤抑制因子[22]。

三、精氨酸剥夺抑制肝癌细胞生长的机制

机制尚不明确。研究发现精氨酸剥夺抑制多种肿瘤细胞生长，可能机制总结如下：(1)直接影响蛋白质合成，特别是富精氨酸核组蛋白合成。(2)诱导细胞凋亡。精氨酸剥夺通过调节Cyclin和CDK导致了肝癌细胞G2/M期停滞和caspase依赖的凋亡[23]。(3)诱导细胞自噬。精氨酸剥夺可通过溶酶体氨基酸转运体SLC38A9抑制mTORC1途径而诱导自噬[24]。前列腺癌中精氨酸剥夺抑制mTOR信号通路，说明它也可能诱导自噬。(4)抑制血管生成。ADI在体外实验中抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移，体内实验中抑制肾癌肿瘤血管生成[17]，这可能与ADI调控细胞外精氨酸水平来抑制NO合酶而导致NO下调有关(图2)。

四、精氨酸剥夺的途径

基于上述机制，精氨酸剥夺治疗肝癌取得一定成果，并处于研究活跃领域(表2、3)。实际上，早在1953年BACH等就发现精氨酸酶通过破坏精氨酸而抑制Jensen肉瘤细胞的有丝分裂[25]。由于Km值、适宜pH要求和底物特异性等限制，精氨酸脱亚胺酶(ADI)和精氨酸酶现为精氨酸剥夺最常用的酶(图2)。

(一)ADI 聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶(ADI-PEG20)抗原性减弱，半衰期增加至7天，可将精氨酸浓度从130 μmol/L降至可检测水平 (2 μmol/L)以下[23, 26]。

在转移性肝细胞癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，患者每周肌肉注射ADI-PEG20 160 IU/m2。47%(9/19)的患者显示出临床应答，其中2人为完全应答。所有患者的中位生存期延长到至少410 d，其中4人存活至680 d[23]。在另一个临床Ⅱ期试验中，76位转移性肝细胞癌患者随机接受80或160 IU/m2每周的ADI-PEG 20治疗共6个月，所有患者的中位生存期大于15.8个月[27]。试验中，患者耐受良好。另有一个全球的临床Ⅲ期实验正在进行中，以进一步确定ADI-PEG在肝癌中的有效性(表2)。

(二)精氨酸酶 经修饰的聚乙二醇重组人精氨酸酶(Peg-rhArg)延长半衰期至6 d，降低对精氨酸的Km值至2.9 mM[28]。

Peg-rhArg的临床Ⅰ期试验在晚期肝癌中进行。试验中单次静脉注射剂量从 500 U/kg 到 2500 U/kg，在1 600～2 500 U/kg时可实现充分的精氨酸耗竭(血清精氨酸水平<8 uM)。在2 500 U/kg时1位患者出现了剂量限制性毒性。试验中最好的应答仅是病情稳定(>8周)，占26.7%(4/15)，且有7位患者因疾病进展太快未纳入结果评估，如纳入，病情稳定率将更低[29]。

图2 精氨酸剥夺的机制及耐药机制

图3 干预肝癌细胞中嘧啶从头合成

NTC编号分期治疗方案对照入选人数地区起始时间(预计)完成时间NCT02101593*[2]ⅠADI-PEG20+索拉菲尼NA[3]8美国2014.112016.2NCT02006030ⅡADI-PEG20+TACETACE40中国台湾2014.62016.9NCT01287585ⅢADI-PEG20安慰剂636美国、中国、韩国、中国台湾、英国、意大利2011.72016.6NCT00056992*ⅡADI-PEGNA34美国2002.92003.10NCT02029690ⅠADI-PEG20+顺铂+培美曲塞NA88英国2014.42018.8NCT02102022ⅠADI-PEG20+奥沙利铂NA148美国2014.112017.10NCT00988195*ⅠPeg-rhArg阿霉素15中国香港2008.52009.5NCT02089633ⅡPeg-rhArg+奥沙利铂+卡培他滨NA73中国香港2014.42018.3NCT01092091*Ⅰ/ⅡPeg-rhArgNA20中国香港2010.32012.2NCT02089763ⅡPeg-rhArgNA35中国香港2014.42017.4NCT02285101ⅠPeg-rhArgNA36美国2014.112016.6

注：[1]来自https://clinicaltrials.gov/，[2]*表示临床试验已完成，[3]未提供

表3 精氨酸剥夺治疗肝细胞癌临床试验的结果汇总

五、精氨酸剥夺治疗肝细胞癌的局限性

精氨酸剥夺在治疗肝细胞癌中取得了一定成效，但仍有一定局限性。(一)有效率低(表3)。原因可能如下：(1)ASS1阴性可能存在精氨酸非依赖的其他效应；(2)循环来自ADI的瓜氨酸需要ASS1和ASL，而循环来自精氨酸酶的鸟氨酸除了ASS1和ASL外还需要OTC(图1)。OTC缺陷的肝癌细胞对ADI天然耐受。故应根据病人基因表达不同而选择ADI-PEG20和Peg-rhArg[28]。(3)病人选择、剂量和用药频率影响了精氨酸剥夺治疗的有效性。(二)耐药。通过研究耐ADI的黑素瘤变异株，发现其产生了一些变化[32]，这可能与耐药相关。(1)ASS1再表达。33%(7/21)ASS1阴性的黑素瘤细胞在ADI治疗后，重新表达ASS1而对ADI耐受。ADI激活Ras/PI3K/ERK信号通路，c-Myc持续稳定表达，结合到ASS1启动子上而增加了ASS1表达。(2)耐药变异体显示出增强的AKT信号通路和减弱的mTOR信号通路，而对PI3K/AKT抑制剂敏感和对mTOR抑制剂耐受。(3)ADI耐药细胞葡萄糖转运体1、乳酸脱氢酶A、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺酶表达增加，同时丙酮酸脱氢酶表达下降，说明糖酵解增强。(4)耐药变异体谷氨酰胺脱氢酶和谷氨酰胺酶表达增加，对谷氨酰胺抑制剂敏感。另外，抗ADI抗体出现。治疗肝癌的2期临床试验中，应用 ADI-PEG20后肝癌细胞中发现了抗ADI抗体，且精氨酸水平出现反弹[30]，抗ADI抗体可能会促进抵抗精氨酸剥夺。(三)精氨酸和NO都有免疫调节作用，精氨酸耗竭方案存在争议。 Rodríguez等[33]发现Peg-rhArg可间接抑制T细胞应答而促进肿瘤生长。Peg-rhArg诱导髓源性抑制细胞增加而抑制小鼠T细胞增殖，并促进了髓源性抑制细胞数量增多的小鼠中肿瘤的生长。Rodríguez等指出精氨酸剥夺治疗有风险。

六、总结与展望

近来，Robinovich等[34]将尿素循环与嘧啶从头合成相联系，发现了ASS1缺乏的精氨酸非依赖效应。细胞质中门冬氨酸是ASS1和嘧啶从头合成中CAD(氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ，门冬氨酸氨基甲酰转移酶和二氢乳清酸酶的总称)的共同底物(图1)。肝癌等细胞缺乏ASS1，细胞质内门冬氨酸水平增高，这使得CAD活性因底物可利用度和mTOR途径的S6K1磷酸化而增高，促进了嘧啶从头合成，从而促进了癌细胞增殖。

结合上述发现，干预嘧啶合成可用于治疗肝细胞癌。一是抑制citrin，减少嘧啶合成原料，抑制肿瘤增殖。citrin是将线粒体内门冬氨酸运至细胞质的转运体，对于为嘧啶合成提供底物十分重要。二是降低CAD活性。应用mTOR抑制剂雷帕霉素或胸苷酸合成酶抑制剂5-氟尿嘧啶治疗后，细胞增殖受到抑制(图3)。综上，精氨酸剥夺在治疗肝细胞癌上很有前景，但也有一定局限性。干扰嘧啶从头合成与精氨酸剥夺治疗有共通之处，为攻克肝癌提供了新思路。

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(本文编辑：张苗)

国家自然科学基金(81302593)；河南省高等学校重点科研项目(15A320083)

450000 河南 郑州大学第一附属医院感染病科(陈洁，曾庆磊，胡秋月，余炎，余祖江)，重点实验室(李晶晶)

余祖江，Email: johnyuem@zzu.edu.cn

2016-09-03)