超声波辅助酶法优化油茶粕蛋白的提取条件

◎曹海燕 桂 花 李维峰 陈小龙 王娅玲

超声波辅助酶法优化油茶粕蛋白的提取条件

◎曹海燕 桂 花 李维峰 陈小龙 王娅玲

为提高油茶粕蛋白的提取率，先对油茶粕进行超声波辅助、酶预处理，然后利用传统碱提酸沉法进行提取。采用单因素和正交试验选出最佳的超声参数、酶条件并得出最佳提取工艺条件：超声温度50℃，超声功率300W，超声时间60min，纤维素酶添加量1.0%，酶解温度50℃，酶解时间120min，料液比为1∶20（g/ml）pH为4.5。此条件下，油茶粕蛋白质的提取率可达80.83%。而未经超声和酶处理蛋白质提取率仅为49.30%，表明此法可显著提高油茶粕蛋白的提取率。

油茶粕也叫茶籽饼、茶麸、茶枯，呈紫褐色颗粒，是油茶籽经榨油后的渣饼，含有大量的活性物质如酚类、皂苷、多糖、黄酮、蛋白质等。由于茶粕的蛋白质含量较高，可作为高效有机肥，应用在农作物及果树栽种中，效果极佳。

目前，提取油茶粕蛋白研究较多的是采用碱溶酸沉法或油茶籽先用酶预处理再采用碱溶酸沉法提取，都或多或少限制了油茶籽蛋白的利用。为提高油茶籽蛋白的提取率，先对油茶粕进行超声波处理，再经酶处理，再利用传统的碱溶酸沉法提取，为提高油茶粕蛋白的利用提供了参考依据。

材料和方法

材料与试剂

材料：茶粕来源于普洱云南淳普油脂有限公司，茶粕经干燥、粉碎、80目过筛等预处理备用。

试剂：无水乙醇、盐酸、浓硫酸、硫酸铜、氢氧化钠，均为分析纯；活性炭；a-淀粉酶(活力单位2000～5000U／g)、纤维素酶(活力单位大于等于15000U／g)。

主要仪器与设备

电热恒温水浴锅(DSY-2.8)：浙江余姚工业仪表三厂；85.2型微型织物试样粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；台式离心机(TDL-5)：上海安亭科学仪器厂；TL-18M型台式高速冷冻离心机：上海市安亭科学仪器厂；生化培养箱(PYX-280S. A)：宁波江南仪器有限公司；AB204-E型电子分析天平、pH计：Mettlertoledo，Switzerland；101-1-S型数显鼓风干燥箱、101-1-S型真空干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；K9840型自动凯氏定氮仪、SH220型石墨消解仪、SOX406型脂肪测定仪：济南海能仪器股份有限公司；DF-1型集热式磁力搅拌器：常州市国华电器有限公司；FZ102型微型植物粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；CX-500型超声波清洗机：北京医疗设备二厂。

试验方法

原料预处理。油粕经70℃～80℃的烘箱中烘干，粉碎，过80目筛。称取适量的上述茶粕粉末，加入10倍体积的70%乙醇溶液，以功率100W，超声波辅助处理10min以去除茶皂素，抽滤，取渣，得到脱脂脱皂茶粕。

茶粕蛋白的提取方法。茶叶籽→去壳→去皮→粉碎→烘干(真空干燥)→过筛(80目)→脱脂(有机溶剂萃取)→脱溶→溶解(加水)→超声波处理→酶处理→浸提(碱液)→离心(4000r／min，30min)→提取液(上清液)→调等电点→离心(4000r／min,20min)→沉淀→调至中性→冷冻干燥→茶叶籽蛋白

实验经过超声波处理、酶预处理后，又参考丁丹华等碱提酸沉工艺的较佳条件进行油茶粕蛋白的提取。

分析方法。粗蛋白含量的测定：微量凯氏定氮法，参照GB／T5009.5—2003；粗脂肪含量的测定：索氏抽提法，参照GB 5512—85；水分含量的测定：常压烘干法，参照GB／T 3543．6一1995；粗纤维的测定：参照GB 5514—85；灰分的测定：参照GB／T 8307—2002；还原糖的测定3，5一二硝基水杨酸法，参考GB／T 5513—85。

蛋白质提取率。采用凯氏定氮法测定蛋白质含量。

蛋白质提取率=(干燥后茶粕蛋白中蛋白质含量／原料中蛋白质含量)×100%。

油茶籽粕蛋白等电点的测定。称取10g样品，料液比为1∶20,用NaOH调pH至10,温度30℃磁力搅拌浸提1h。离心（3000r/min，20min）取上清液,分别取上清液7份各10mL,加盐酸调pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,离心（3000r/ min，20min),弃上清液后称重,重复一次，绘出沉淀量与pH值的曲线图,图1中沉淀量最大时的pH为蛋白质等电点。

试验设计方案

采用单因素和正交试验选出最佳的提取参数，以碱浸提液pH、浸提温度、浸提时间、超声频率、酶用量、酶解温度、酶解时间、液料比为变量因素，以茶叶籽蛋白提取率为评价指标．优化超声波辅助提取茶叶籽蛋白的工艺条件。

结果与分析

油茶籽粕蛋白等电点测定

油茶籽饼粕蛋白等电点结果见图1。

加酸至等电点是从提取液中分离蛋白的最简便方法，它能确保提取液中蛋白质最大量的沉淀。因此，等电点的选择是关键步骤。由图1可知，油茶籽粕蛋白的沉淀量在pH为4.5时最大，故油茶籽蛋白提取最佳等电点为4.5。

超声处理条件对蛋白质提取率的影响

超声温度对油茶籽蛋白提取率的影响。将过80目筛的脱脂粕取等量，按料液比

1∶20、pH10、超声时间60min、超声功率300W，考察超声温度对油茶籽蛋白提取率由图2可知，超声温度为50℃时，油茶籽提取率最大。因为超声温度低于50℃时，分子扩散运动小，油茶籽粕中的蛋白质与溶剂的相互作用不够完全，从而降低了油茶籽蛋白提取率；而温度高于50℃后，由于物料略有糊化，且部分蛋白质发生局部变性可能使得油茶籽蛋白提取率降低，故选择超声波处理温度为50℃。

超声时间对油茶籽蛋白提取率的影响。将80目筛的脱脂粕取等量，在料液比1∶20、pH10、超声温度50℃、超声功率300W的条件下，考察超声时间对油茶籽蛋白提取率的影响，结果见图3。

由图3可知，一开始油茶籽蛋白提取率随时间的增加而增大，当超声波处理时间为60min时，达到最大值，之后随时间的延长得率逐渐下降。这是由于在前60min内超声波对细胞膜的破碎作用较强，蛋白溶出物增多，得率不断升高；而60min后内蛋白质得率下降，这可能是因为随着超声时间的增加，温度急剧升高，导致蛋白质分解或变性所致，故超声波处理时间选择60min。

超声功率对油茶籽蛋白提取率的影响。将过80目筛的脱脂粕取等量，按料液比1∶20、pH10、超声温度50℃、超声时间60min，考察超声功率对油茶籽蛋白提取率的影响，结果见图4。

由图4可知，起初油茶籽蛋白提取率随着超声功率的增大而逐渐增大，在300W时达到最大值，之后蛋白提取率下降，这可能是超声波功率未达到300W前对细胞的空化作用逐渐增大，导致细胞破壁更充分，蛋白分离出来，到达300W后，油脂又和蛋白结合，导致蛋白提取率下降，所以选择超声波处理功率300W。

纤维素酶预处理条件对茶粕蛋白质提取的影响

纤维素酶添加量的确定。称取一定量的脱脂脱皂茶粕，过80目筛后平均分为3份。设定预处理温度为50℃，时间为9.0h，纤维素酶添加量分别为0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%。测定茶粕蛋白质含量并计算蛋白质提取率确定合适的加酶量范围。提取结果见图5。

结果表明，随着加酶量的增加，蛋白质提取率也不断增大；加酶量在0.4%至0.7%区域，蛋白质提取率增幅较小并略有降低；加酶量在0.1%至0.4%和0.7%至1.0%区域，蛋白质提取率增福最大，但加酶量在0.1%时，蛋白质提取率最高，达74.2%；加酶量为1.0%至1.3%区域，蛋白质提取率增福平缓。经酶处理后的蛋白质提取率比不加酶时的提取率(49.30%)明显增加。最后,考虑到成本等因素,纤维素酶1.0%。

酶解时间的确定。在淀粉酶2.0%、纤维素酶1%，酶解温度50℃，pH5条件下对茶粕处理，酶解时间分别为30、60、90、120、150min，酶灭活后按较佳碱提工艺对茶粕蛋白提取，提取结果见图6。

由图6可知，随着时间的延长，蛋白质提取率相应提高。酶解时间为30min时，茶粕蛋白提取率在62.5%，酶解时间为150min时，茶粕蛋白提取率在76.5%。酶解时间为120min时，茶粕蛋白提取率趋于平稳。但考虑到节约能源等因素，酶预处理茶粕蛋白时间为120min。

酶解温度的确定。淀粉酶添加量2.0%、纤维素酶添加量1%，酶解时间120min，pH为5条件下对茶粕蛋白预处理，酶解温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，酶灭活后按较佳碱提工艺对茶粕蛋白提取，提取结果见图7。

由图7可知，温度对蛋白质提取有较大影响。蛋白质提取率在温度30℃至40℃范围内不断升高，40℃至50℃范围内变化不大，当温度超过50℃时，蛋白质提取率开始下降，可能由于高温使酶蛋白变性失活所致，所以在提取茶粕蛋白时选取50℃为最适温度。

pH的确定。在淀粉酶添加量2.0%、纤维素酶添加量1%，料液比1∶20，酶解温度50℃，酶解时间120min的条件下对茶粕预处理，pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶灭活后按较佳提取工艺对油茶粕蛋白提取，提取结果见图8。

由图8可知，随着pH值的变化，茶粕蛋白的提取率变化较大.在pH4.5时，提取率达到最大值，为77.40%。在pH5.0时，油茶粕蛋白的提取率为73.10%。此后，随着pH值的增加，提取率继续下降,但下降缓慢。所以在提取茶粕蛋白时选择酶预处理的pH值为4.5。

讨论

对于提取油茶粕蛋白，报道最多是酶预处理方法的研究，实验采用超声波辅助，酶预处理后，再采用传统的碱溶酸沉法提取。超声辅助酶预处理后再结合碱溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，与传统的碱溶酸沉法相比，具有提取时间更短、提取温度更低、油茶籽蛋白提取率更高等优点。

结论。油茶籽粕蛋白的等电点pH值为4.5时，此时蛋白质的沉淀量最大。采用超声波辅助，酶预处理油茶籽粕的最佳条件为：超声波处理温度为50℃,超声处理时间60min，超声波处理功率为300W，料液比1∶20，纤维素酶1.0%，酶预处理时间为120min，酶解温度50℃，酶预处理的pH值为4.5，在此条件下，按照碱溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，蛋白质的提取率可达80.83%。实验结果表明，采用传统的碱溶酸沉法再结合超声辅助和酶预处理，能够从油茶籽粕中获得较高提取率的油茶籽蛋白。这对于油茶籽蛋白的产品开发具有重要的指导意义。

(作者单位：云南农业大学热带作物学院热带作物与食品工程系)