乙型肝炎病毒B、C基因型全基因组序列的克隆*

赵建华，陆仁飞

(江苏省南通市第三人民医院检验科 226006)



·论 著·

乙型肝炎病毒B、C基因型全基因组序列的克隆*

赵建华，陆仁飞△

(江苏省南通市第三人民医院检验科 226006)

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型全基因组序列克隆。方法 从HBV无症状慢性携带者中筛选B、C基因型，提取病毒核酸，设计引物，应用高保真酶对3 200 bp的HBV DNA进行全序列扩增，通过克隆技术构建pGEM-HBV重组质粒，测序后进行序列分析。结果 获得HBV B基因型和HBV C基因型重组质粒各1株。结论 成功构建HBV B基因型和HBV C基因型的全基因组序列克隆，可为进一步研究HBV分子流行病学和基础研究提供工具。

乙型肝炎病毒； B基因型； C基因型； 全基因组序列； 克隆

乙型肝炎病毒(HBV)是严重威胁人类健康的病原体，全球约有20亿人感染过HBV，其中超3.5亿人发展为慢性感染者。我国是HBV感染流行的高发区[1-2]。由于HBV在复制过程中缺乏校对酶作用，容易发生核苷酸配对错误，长期突变累积形成不同基因型。根据“HBV全基因组序列大于92%”的标准，可将HBV分为A～H 8种基因型[3]，HBV基因型研究不仅与HBV的分子流行病学和基础医学研究密切相关，且与病毒感染后的临床进展相关[4]。我国HBV基因型以B、C型为主[1]。HBV DNA是双链非闭合的松弛结构，正负2条链不等长，加之基因组长度为3.2×103，使得HBV全基因组的扩增和克隆较难。本研究采用一步法长距离聚合酶链式反应(PCR)的方法获得完整的3.2×103HBV全基因组，进一步构建HBV基因B、C型质粒，为后续的HBV研究提供工具。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 30例无症状HBV携带者，诊断符合2000年9月全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准[5]，患者未经任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒药物治疗。HBV血清标志物包括表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗HBsAb)、e抗原(HBeAg)、e抗体(抗HBeAb)、核心抗体(抗HBcAb)。抽取患者血液，分离血清。

1.2 仪器与试剂 血清病毒核酸提取试剂盒由厦门至善生物公司提供；HBV DNA定量试剂盒购于上海科华生物科技有限公司；HBV基因分型试剂盒购于上海之江生物公司；E.Z.N.A gel extraction kit、E.Z.N.A plasmid mini kit购于Omega公司；Kod-Plus聚合酶购于TOYOBO公司；T-easy vector 购于Promega公司；DH-5α由南通大学病原生物学实验室惠赠；限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ购于大连TaKaRa公司；PCR扩增仪为ABI-7500荧光定量PCR仪，凝胶成像系统为SYN-GBOX。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA核酸提取 吸取100 μL血清，严格按照血清中病毒核酸提取试剂盒(手工法100 μL体系)说明书操作，最后用50 μL洗脱液洗脱。

注：F1为5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3′；R1为5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3′。

1.3.2 HBV DNA定量检测及HBV B、C基因型筛选 HBV DNA定量检测采用实时荧光定量PCR法，操作按说明书；HBV B、C基因型检测采用TaqMAn荧光探针PCR法，操作按说明书。

1.3.3 引物 引物设计参考Gunther等[6]的引物序列，以HBV负链开口处为克隆序列的起始点，引物由英骏生物上海合成部合成，见图1。

1.3.4 HBV的全基因组序列扩增 扩增所用高保真聚合酶Kod-Plus 酶购自TOYOBO公司。PCR扩增反应体系参照说明书。扩增循环参数为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3.5 min，共35个循环。扩增产物加A，加A反应条件为72 ℃ ，30 min；加A产物胶回收。

1.3.5 HBV全基因组序列的克隆及鉴定 胶回收产物与pGEM-Teasy载体4 ℃连接16 h；连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑取阳性菌落，抽提质粒，SALⅠ、ECORⅠ酶切鉴定。

1.3.6 HBV全基因组序列克隆质粒测序及分析 选择经酶切鉴定证实含3 200 bp片段的重组质粒送上海华大基因测序部测序，测序结果进行Genebank比对，DNASTAR分析。

2 结 果

2.1 HBV B、C基因型的筛选 以患者血清中提取的HBV DNA为模板，实时荧光定量PCR法测定病毒载量，见图2；以提取的HBV DNA为模板，TaqMan荧光探针PCR法筛选HBV B、C基因型，见图3。

图2 实时荧光定量PCR法测定病毒载量

图3 TaqMan荧光探针PCR法筛选HBV B、C 基因型

注：1为阴性对照；2为患者血清HBV DNA作模板的PCR产物；3为DNA Marker。

2.2 HBV DNA的扩增 以筛选到的HBV B、C基因型的HBV DNA为模板，利用F1和R12条引物扩增HBV基因组， PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约3 200 bp处有特异性扩增条带，见图4。

2.3 构建质粒的酶切鉴定 为验证重组质粒中是否插入3 200 bp的目标序列，提取质粒后进行酶切鉴定。结果显示：在pGEM-Teasy Vector中插入了3 200 bp大小的片段，见图5。

注：1、4为pGEM-HBV质粒；2、5为ECORⅠ单酶切；3、6为SalⅠ单酶切；M为 DNA Marker。

图6 HBV-B2序列

2.4 序列分析 测得序列，剔除载体序列，通过Genbank进行核苷酸比对，2株HBV重组质粒的基因型为B型和C型，获得2个HBV全基因组序列长度分别为3 215 bp和3 216 bp，能够完整翻译HBV所有蛋白，分别将其命名为HBV-B2和HBV-C1，见图6、7。通过MEGA 4软件对其基因进行分型，确定其为B、C基因型，见图8(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

图7 HBV-C1序列

3 讨 论

本研究对象选取未接受任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒药物治疗的无症状携带者。我国HBsAg的流行率大约为10%，其中大部分是无症状携带者[1,7]。由于未经过、未接受任何HBV疫苗免疫和任何抗病毒药物治疗，宿主中HBV毒株受到的免疫压力和药物筛选作用小，在感染过程中病毒变异发生率低，能确实反映我国HBV流行株存在情况，具有更广的代表性，其构建的HBV全基因组克隆可为HBV相关研究提供有利条件。

HBV基因型分布有较显著的地域特征，A、D型主要分布在欧洲和美国，B、C型主要分布在东南亚和东亚，E型主要在西非流行，F型集中在中南美洲，而G型仅在个别国家有单个案例报道[7-8]。我国以B、C基因型为主，本试验构建的HBV B、C基因型全基因组序列克隆顺应了我国HBV研究的需要。

然而，在对30个无症状携带者筛选B、C基因型过程中，笔者发现，只有1例患者是B基因型，其余29例均为C基因型，与以往的文献报道B、C基因型比例相差较大[8-11]。此可能与样本量太小无统计学意义，采用TaqMan荧光探针法没有测序法精确，大规模疫苗接种和临床抗病毒药物的广泛使用造成B、C基因型比例改变等相关，具体原因有待下一步试验研究证实。

以往研究中，扩增HBV全基因组根据所使用引物数目的不同，可以分为一片段法(使用1对引物)和多片段法(使用多对引物)。由于HBV突变率相对较高，同一患者体内的HBV DNA序列是以1个准种池的形式呈现[12-15]，而非单一序列，本试验采用了一步法长距离PCR扩增HBV全基因组序列，避免了多次PCR拼接所导致的“人工假基因组”现象。

HBV DNA是双链非闭合的松弛结构，正负2条链不等长，加之基因组长度为3.2×103，使得HBV全基因组的扩增和克隆难度较高。因此，提取病毒DNA的效率及完整性、聚合酶的保真度和扩增效率将是试验成败的关键。笔者通过高温裂解法、柱提法、磁珠提取法比较发现，高温裂解法虽然有较高提取效率但提取的核酸无法扩增全长(可能由于高温碱裂解打断了DNA链完整性)；柱提法能将病毒载量大于1×106copy/mL血清提取的核酸扩增到3.2×103的HBV全基因组，而从病毒载量小于1×106copy/mL血清提取的核酸很难扩增到3.2×103的HBV全基因组；磁珠提取法能从病毒载量大于1×105copy/mL血清提取的核酸扩增到3.2×103的HBV全基因组。因此，笔者推断磁珠法更适合低滴度长片段核酸的提取。普通的Taq DNA 聚合酶有很强5′→3′的聚合酶活性，但是缺乏3′→5′核酸外切酶活性，无法消除扩增过程中与模板链错配的现象，本试验的PCR酶采用了TOYOBO公司的Kod-Plus酶,Kod-Plus酶具有较高的DNA合成效率以及PCR保真度，其保真度大约为普通Taq DNA聚合酶的82倍[11]，但是，Kod-Plus具有较强的3′→5′核酸外切酶活性，使其扩增的PCR产物末端被平滑化，故不能直接进行TA克隆。为便于PCR产物与pGEM-Teasy载体连接，必须在PCR后，对PCR产物末端进行加A反应，增加TA克隆效率。

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Cloning of complete-genome sequence of hepatitis B virus genotype B and C*

ZHAOJianhua,LURenfei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NantongMunicipalThirdPeople′sHospital,Nantong,Jiangsu226001,Chian)

Objective To construct the clone of full-genome sequence of hepatitis B virus(HBV) genotype B and C.Methods HBV genotype B and C were screened from asymptomatic carriers of HBV for extracting HBV nucleic acid and designing primer.The high fidelity enzyme was used to perform the full sequence amplification of 3 200 bp HBV DNA.The pGEM-HBV recombinant plasmid was constructed by using the clone technique.Then the sequence analysis was performed after sequencing.Results Each strain of recombinant HBV genotype B and C was obtained.Conclusion The clone of full-genome sequence of HBV genotype B and C is successfully constructed,which can provide a tool for further study of HBV molecular epidemiology and basic study.

HBV; genotype B; genotype C; complete genome sequence; clone

江苏省南通市卫生和计划生育委员会资助项目(WQ2014038，W201217)；江苏省南通市科技局资助项目(HS2014062)。

赵建华，男，副主任技师，主要从事临床微生物方面的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.004

A

1673-4130(2016)22-3101-04

2016-04-15

2016-06-21)