国产细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒的性能评估*

方宜臻，叶辉铭，刘江武，金宏伟，林永志，颜水堤，于 洋，高 磊，徐飞海，张忠英△

(1.厦门大学附属中山医院检验科，福建厦门 361000；2.厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，福建厦门 361000)



·临床研究·

国产细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒的性能评估*

方宜臻1，叶辉铭1，刘江武2，金宏伟1，林永志1，颜水堤1，于 洋1，高 磊2，徐飞海2，张忠英1△

(1.厦门大学附属中山医院检验科，福建厦门 361000；2.厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，福建厦门 361000)

目的 对厦门万泰凯瑞生物技术有限公司的细胞角蛋白19片段非小细胞肺原相关抗原21-1(CYFRA21-1)化学发光定量检测试剂盒进行分析性能评估。方法 依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》等文件对试剂盒的敏感性、线性范围、可报告范围、准确度、精密度、交叉反应等性能进行评估，同时与电化学发光法平行比对，检测配对血清/血浆结果的一致性。结果 该试剂盒检测最低限为0.1 ng/mL；线性范围为 0.1～1 000.0 ng/mL；可报告范围达0.1～2 000.0 ng/mL；批内精密度为6.15%～9.46%，批间精密度为7.57%～11.00%；回收率达99.60%；与多种常见肿瘤抗原无交叉反应；轻度溶血、胆红素小于或等于340 μmol/L、三酰甘油小于或等于18.1 μmol/L及类风湿因子小于或等于400 U/mL时，对试剂无显著干扰；与电化学发光法检测总符合率为98.56%，一致性良好(P<0.05，Kappa=0.965)；血清、血浆标本检测一致性良好(P<0.05，Kappa=0.936)。结论 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司生产的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒各项性能评估良好，可满足临床检测要求。

细胞角蛋白19片段； 试剂； 化学发光免疫分析法； 方法学评价

细胞角蛋白是一种构成上皮组织中间纤维亚单位的结构蛋白，是细胞骨架的重要组成部分[1]。人体中约有20种相对分子质量为(40～70)×103的角蛋白，其中细胞角蛋白19在正常状态下水平极低，当细胞恶性变时大量细胞角蛋白19的可溶性片段释放入血，通过2种特异性单克隆抗体KS19.1和BM19.21可测定出相对分子质量约为30×103的细胞角蛋白19片段[2]。众多研究发现，血液、尿液中的细胞角蛋白19片段是一种重要肿瘤标志物，在非小细胞肺癌[3]、鼻咽癌[4-5]、膀胱癌[6-8]、食管癌等肿瘤中均具有良好的临床诊断价值[9]。

目前，非小细胞肺癌相关抗原21-1(CYFRA21-1)的检测方法主要以电化学发光法和化学发光法免疫分析法为主，2种方法具有高敏感性、高特异性、高稳定性等优点，但是95.00%以上的市场份额都被国外品牌所占领，且试剂盒成本昂贵。因此，开发具有自主知识产权，评估并使用性能稳定、优良的国产CYFRA21-1化学发光法免疫分析试剂盒是打破国外品牌长期垄断局面的有效途径，能大大降低临床检验CYFRA21-1的成本，降低医疗费用。

厦门万泰凯瑞生物技术有限公司与本实验室合作，对厦门万泰公司的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量检测试剂盒的敏感性、线性范围、交叉反应等性能进行评价，同时与德国罗氏公司的CYFRA21-1定量测定试剂盒(电化学发光法)进行平行比对，结果显示国产试剂各性能指标良好。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 (1)比对血清：2013年7月患者血清标本中选取348例标本，用于试剂A、B平行比对试验。(2)准确度验证试验血清：标本库选取1例健康人血清，用于准确度验证试验。(3)可报告范围试验血清：标本库中选取5例不同CYFRA21-1水平低值标本和3例不同CYFRA21-1水平高值标本用于可报告范围验证试验。(4)精密度试验标本：标本库中选取选1例低值及1例高值血清(血清标本1、血清标本2)用于精密度试验。(5)血清/血浆相关性分析标本：收集2013年7月99例子患者配对血清/血浆标本共99对198例，用于血清/血浆一致性分析。(6)交叉反应试验标本：标本库中选取42例甲胎蛋白(AFP)、肿瘤抗原(CA)12-5、CA15-3、CA19-9、癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌相关性抗原(SCC)分别为阳性且CYFRA21-1经电化学发光法检测为阴性的标本，用于交叉反应试验。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 采用CARIS系列化学发光仪(厦门优迈科医学仪器有限公司)，COBAS e601(德国罗氏公司)。

1.2.2 试剂 (1)试剂A：厦门万泰凯瑞生物技术有限公司生产的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1定量检测试剂盒(批号RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)；(2)试剂B：德国罗氏公司的非小细胞肺癌相关抗原21-1定量测定试剂盒(批号173353)；(3)干扰物：胆红素(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批号39340)、三酰甘油(Aladdin Chemistry Co.Ltd，批号55543)、类风湿因子(Biorbyt，批号D6987)；(4)L系列参考品(厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，批号20130326)；(5)参考品M(0水平校准品，厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，批号20130326)；(6)企业一级校准品(厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，批号20130314)。

1.3 方法

1.3.1 分析敏感性评价 试剂A检测梯度稀释的L系列参考品并拟合剂量反应曲线，同时重复测定0水平校准品20次，计算最低检测限。

1.3.2 线性范围评价 参考CLSI EP-6A文件提供的方案并依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》[10]，用试剂A 检测梯度稀释的企业一级校准品，以校准品水平对数为X，测定水平平均值对数为Y建立回归方程并计算偏离直线平均差异(ADL)，评价其线性范围。

1.3.3 可报告范围评价 参考CLSI EP-6A文件并依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》[10]，试剂A重复检测5个水平的低值标本(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5)及3个不同水平的高值标本(H1、H2、H3)。变异系数(CV)≤10.00%的最低水平作为可报告范围低限。高值标本还原水平与理论水平偏差不超过(±10.00)%时，其还原水平为可报告范围高限。

1.3.4 准确度评价 20 μL稀释校准品加入180 μL健康人血清制得混合血清，将稀释校准品、正常人血清及混合血清重复测量3次，参考 CLSI EP9-A2文件并根据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》计算准确度[11]。

1.3.5 精密度评价 基于《YYT 1175-2010 肿瘤标志物定量测定试剂(化学发光免疫分析法)》的有关要求并参考CLSI EP5-A文件[12]，用3批试剂(批号：RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)检测血清标本1、2并计算批内和批间CV。

1.3.6 干扰试验 参考CLSI EP7-A文件并依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》[13]，用3批试剂(批号RM2013031501、RM2013031601、RM2013031701)分别检测同一患者溶血前与溶血后的血清标本，考察轻度溶血对试剂准确度的影响；用健康人血清稀释胆红素溶液、三酰甘油溶液及类风湿因子溶液，测试胆红素、三酰甘油及类风湿因子对试剂检测准确度的影响。计算添加干扰因素前后的百分偏差(Bias)，以超过±10.00%判定为存在干扰。

1.3.7 交叉反应验证 试剂A检测42例交叉反应试验标本，用于交叉反应的验证。

1.3.8 试剂A与试剂B平行比对试验 试剂A、B平行测定347例患者血清CYFRA21-1水平，以试剂B的结果为X，试剂A结果为Y，构建线性回归方程。同时，根据各试剂的参考范围将结果判为CYFRA21-1异常或正常，计算总符合率并进行一致性分析和相关性分析。

1.3.9 血浆/血清相关性分析 试剂A检测99对198例配对血清/血浆标本，比较血清、血浆标本检测结果的一致性、相关性并以血浆检测结果为Y，血清检测结果为X进行简单线性回归分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。采用多项回归分析并计算ADL，当ADL小于相应临界值时认为多项式具有临床可接受的非线性；一致性评价采用Kappa一致性检验，相关性分析采用Pearson相关性分析，线性回归分析采用简单线性回归分析，当P<0.05时表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分析敏感性评价 剂量反应曲线见图1，试剂A最低检测水平平均值为0.095 2 ng/mL，该试剂盒最低检出限为0.1 ng/mL。

图1 试剂A (RM2013031501)的剂量反应曲线

2.2 线性范围评价 检测结果，见表1。PctBnd取5.00%时， ADL均小于其临界值具有临床可接受的非线性，见表2。因此，本试剂盒线性范围为0.1～1 000.0 ng/mL。

表1 试剂A(RM2013031501)对企业一级校准品梯度稀释的检测结果(ng/mL)

表2 试剂A(RM2013031501)多项式回归方程及线性检验

注：-表示无数据。

2.3 可报告范围评价 可报告范围的结果，见表3、4。水平为0.076～0.206 ng/mL时，CV值均小于10.0%，所以0.1 ng/mL为可报告范围低限。高值标本进行2倍稀释时，CV值小于5.00%且还原水平与理论水平的偏差Bias均小于10.00%，可报告范围高限为2 000.0 ng/mL，因此该试剂盒可报告范围为0.1～2 000.0 ng/mL。

表3 试剂A(RM2013031501)可报告范围下限检测结果

表4 试剂A(RM2013031501)可报告范围上限检测结果

2.4 准确度评价 回收率为95.60%～103.70%，平均回收率为99.60%，定量准确性良好。

2.5 精密度评价 批内精密度为6.15%～9.46%，批间精密度为7.57%～11.00%，试剂盒的重复性良好，见表5。

2.6 干扰试验 溶血、胆红素、三酰甘油及类风湿因子对试剂A影响较小，添加干扰因素后的Bias均在10.00%以内。见表6。

表5 试剂A精密度

注：血清标本1批间CV为7.57%，血清标本2批间CV为11.00%。

表6 不同干扰因素对试剂检测结果的影响

2.7 交叉反应验证 AFP、CA125、CA15-3、CA19-9、CEA、SCC对试剂A的交叉反应物水平分别为：31.54～244.72 ng/mL、104.8～516.2 U/mL、72.63～189 U/mL、134.2～801.3 U/mL、119.9～379.6 ng/mL、11.9～35.8 ng/mL，试剂A对多种肿瘤抗原交叉反应试验结果均为阴性。

图2 A、B试剂血清CYFRA21-1检测结果线性相关拟合

2.8 试剂A与试剂B平行比对试验 试剂A与试剂B呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=1.524X-1.889(R2=0.975，P<0.05)，见图2。同时，一致性比较及相关性分析的结果显示试剂A与试剂B具有良好的一致性(Kappa=0.971，P<0.05)及相关性(r=0.987，P<0.05)，总符合率为98.56%。

2.9 血浆/血清相关性分析 配对血浆/血清标本的测定结果具有良好一致性(Kappa=0.936，P<0.05)及相关性(r=0.949，P<0.05)，线性回归方程为Y=0.947X+0.242(R2=0.900，P<0.05)，见图3，因此试剂A对血清和血浆的检测结果差异无统计学意义。

图3 血清、血浆CYFRA21-1测定结果线性相关拟合图

3 讨 论

CYFRA21-1是一种临床肿瘤标志物，尤其对非小细胞肺癌有重要诊断价值。目前，国内检测CYFRA21-1多以罗氏、雅培等国外品牌为主，临床检验成本昂贵。因此，国产CYFRA21-1化学发光免疫试剂盒的研究、应用和推广对降低医疗费用、提升患者满意度具有重要社会意义。万泰凯瑞生物技术有限公司与本实验室合作，对厦门万泰凯瑞生物技术有限公司的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒的敏感性、线性范围、可报告范围、准确度、精密度、干扰试验、交叉反应进行评估，并与试剂B(化学发光法)进行平行比对，结果显示，该试剂盒各项检测性能均可满足临床检验要求，且适用于血清及血浆标本。

干扰试验结果表明胆红素、三酰甘油及类风湿因子不会对检测结果造成影响，但本试验添加的外源性胆红素、三酰甘油、类风湿因子水平分别为0～340 μmol/L、0～18.1 mmol/L和0～400 U/mL，因此，对于胆红素水平高于340 μmol/L、高乳糜浊度及高类风湿因子水平标本，本试剂盒的抗干扰能力还有待进一步改良。同时，溶血前后血清标本检测结果显示，轻度溶血对检测结果影响较小，但中、重度溶血对该试剂盒的抗干扰能力还未验证，临床上应避免中、重度溶血对本试剂盒检测结果的影响。

在方法学平行比对试验中，试剂A与试剂B(电化学发光法)有较好相关性，其检测结果与电化学发光法等效，而线性范围高于电化学发光法(电化学发光法的检测范围为0.1～500 ng/mL，试剂A为0.1～1 000.0 ng/mL)。同时，试剂A可报告范围为0.1～2000.0 ng/mL，高于电化学发光法的0.1～1000.0 ng/mL，表明该试剂盒相较于电化学发光法不仅有价格优势，部分指标性能更优于罗氏，有广阔的应用前景。

[1]Maeda Y,Segawa Y,Takigawa N,et al.Clinical usefulness of serum cytokeratin 19 fragment as a tumor marker for lung cancer[J].Internal Medicine,1996,35(10):764-771.

[2]Stieber P,Hasholzner U,Bodenmuller H,et al.CYFRA 21-1.A new marker in lung cancer[J].Cancer,1993,72(3):707-713.

[3]Zhang ZH,Han YW,Liang H,et al.Prognostic value of serum CYFRA21-1 and CEA for non-small-cell lung cancer[J].Cancer Medicine,2015,4(11):1633-1638.

[4]Zhu WQ,Yu JM,Sun XD,et al.Serum CYFRA21-1 as a prognostic marker for patients with undifferentiated nasopharyngeal carcinoma[J].Biomarkers,2010,15(7):602-607.

[5]Song XM,Wang SZ,Wang ZJ,et al.Serum CYFRA21-1 as an effective tumor biomarker for patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Neoplasma,2015,62(1):124-129.

[6]Kuang LI,Song WJ,Qing HM,et al.CYFRA21-1 levels could be a biomarker for bladder cancer:a meta-analysis[J].Genetics and Molecular Research,2015,14(2):3921-3931.

[7]Huang YL,Chen J,Yan W,et al.Diagnostic accuracy of cytokeratin-19 fragment(CYFRA 21-1)for bladder cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Tumour Biology,2015,36(5):3137-3145.

[8]叶辉铭,林永志,张忠英.电化学发光免疫分析法检测尿细胞角蛋白19及其在膀胱癌诊断中的应用[J].检验医学,2005,20(6):533-535.

[9]Zhang J,Zhu Z,Liu Y,et al.Diagnostic value of multiple tumor markers for patients with esophageal carcinoma[J].PloS One,2015,10(2):e0116951.

[10]CLSI.EP6-A:Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2003.

[11]CLSI.EP9-A2:Method comparison and bias estimation using patient samples[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2002.

[12]CLSI.EP5-A:Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2004.

[13]CLSI.EP7-A:Interference testing in clinical chemistry[S].Wayne,PA,USA:CLSI,1986.

厦门市重点实验室基金资助项目(3502Z20130006)；福建省科技计划项目(2011D018)。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.031

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1673-4130(2016)22-3177-04

2016-05-21

2016-08-14)