隔药饼灸对子宫内膜异位症大鼠p38MAPK信号通路的干预作用

覃肯,王萍,肖小文,罗薇絮,周志刚



隔药饼灸对子宫内膜异位症大鼠p38MAPK信号通路的干预作用

覃肯1,王萍1,肖小文1,罗薇絮2,周志刚1

(1.江西中医药大学,南昌 330004;2.岳阳天添药用胶囊有限公司,岳阳 414017)

目的 观察隔药饼灸对子宫内膜异位症大鼠p38MAPK信号通路的干预作用。方法 将34只大鼠随机分为A组(空白对照组)8只和造模组26只,造模组大鼠参照子宫内膜异位症造模方法进行造模,然后随机在造模组中选择2只大鼠处死后检验造模结果。将造模成功后的大鼠随机分成B组(隔药饼灸组)、C组(西药组)和D组,每组8只。B组采用隔药饼灸关元穴治疗,C组采用灌服达那唑溶液治疗,D组造模后不予以任何治疗。20 d后处死各组大鼠并取出实验标本。通过荧光定量PCR检测各组样本IFN-g与IL-4的表达;通过Western-blot检测各组样本磷酸化p38MAPK的表达。结果 与A组比较,B组、C组和D组大鼠的IL-4mRNA和磷酸化p38MAPK表达显著上升(均＜0.05),IFN-gmRNA表达显著下降(均＜0.05)。与D组比较,B组和C组大鼠的IL-4mRNA和磷酸化p38MAPK表达显著降低(均＜0.05),IFN-gmRNA表达显著上升(均＜0.05)。与B组比较,C组磷酸化p38MAPK、IL-4mRNA和IFN-gmRNA表达无显著性差异(均＞0.05)。结论 隔药饼灸能抑制p38MAPK信号通路,抑制IL-4的表达,促进IFN-g生成,诱导Th细胞向Th1分化,恢复Th细胞动态平衡。

针灸疗法;子宫内膜异位症;隔物灸;药饼灸疗法;p38MAPK信号通路;Th细胞分化;穴,关元;大鼠

子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)是一种病因尚不明确的复杂性疾病,其临床症状(如痛经、不孕、性交痛等)严重地影响了现代女性的生活质量。有研究[1]表明,约68%的EMs患者表示自己的工作效率受到了影响,约63.3%的患者感觉日常活动受到干扰,患者平均每星期为此而损失的工作时间达8.34 h。EMs的发病机制目前尚不明确,发病学说众多,但均难以诠释清楚EMs的发病机制,广泛接受的病因学说为经血逆流学说。EMs的主要治疗手段是以手术为主,辅以抑制卵巢功能的药物,但长期服用抑制卵巢功能的药物会产生较多不良反应,若采用保守性手术的办法其复发率可达27%～40%,复发后再手术的难度较大,且手术并发症发生率高达30%[2]。以上这些问题均导致EMs成为当代妇科急需攻克的一个疑难疾病。

现代研究表明,Th1/Th2的失衡是导致EMs发生的主要因素之一,当EMs发生时,患者体内Th2细胞及其分泌产物相对正常值显著升高,此时机体整体处于免疫抑制状态,这给异位的子宫内膜细胞侵袭与生长提供了有利的环境[3]。越来越多的证据也表明EMs中子宫内膜组织的种植具有类似于炎症的特征[4]。丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPK)是细胞内一个重要的信号传导通路,其参与了炎症、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程的调节。而在细胞免疫过程中p38MAPK通过调节Th细胞的细胞因子(如IL-4、TNF-a等)来达到调节Th细胞漂移的作用。本研究以磷酸化p38MAPK 和Th1/Th2细胞特征性细胞因子INF-g/IL-4作为观察指标,探讨隔药饼灸对EMs大鼠p38MARK信号通路的干预作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

34只雌性未孕9周龄清洁级SD大鼠,体重为(200±20)g,置于室温[(25±2)℃]中,12 h昼夜循环光照环境下饲养,自由摄食、饮水。动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号SCXK(湘)2013- 0004]。

1.2 药品与试剂

药饼(采用上海中医药大学针灸经络研究所制备的药饼,将附子、肉桂、丹参、红花、木香等药物切细研末,以黄酒调和做成厚约0.4 cm、直径约2 cm大小的药饼,中间用针刺数孔);特制细艾条(南阳汉医艾绒有限责任公司,直径约为5 mm);达那唑胶囊(民生药业生产,国药准字H33022461);Trizol(Aidlab公司提供,批号Lot:252250AX);RNase Inhibitor(TransGen公司提供,批号LOT#I21222);山羊抗兔IgG二抗(中国聚研生物科技有限公司);Western-blot一抗稀释液(碧云天生物技术研究所)。

1.3 仪器

实时荧光定量PCR仪(美国Illumina公司ABI7900型);显微镜(尼康E100型生物显微镜);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司);紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司);Western-blot转膜仪(美国Bio-Rad公司);MiniTrans-blot转移系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4 造模与分组

先将34只大鼠随机分为A组(正常对照组)8只和造模组26只。

造模组术前给予己烯雌酚0.02 mg/kg灌胃5 d,使造模时大鼠统一处于动情期。参照改良后的EMs造模方法[5]造模,即在无菌条件下,3%戌巴比妥纳(50 mg/kg体重)麻醉大鼠后,于大鼠尿道上端约1 cm处,纵向切开皮肤及腹壁,暴露子宫,结扎子宫动脉,并于结扎处上端切除1段长度为1～2 cm的子宫片段,且迅速将其置于洛氏营养液中,而后将断开的子宫两端用7-0无菌眼科线行端端缝合操作。在营养液中将子宫内膜与子宫基层分离成面积约5 mm×5 mm大小的正方形片段,然后将其固定并缝合在左侧腹壁上。0.9%生理盐水冲洗移植处,洒入适量的头孢氨苄胶囊粉末,最后逐层关闭大鼠腹部,并进行消毒。术毕将动物笼单放,让其自然苏醒。7 d后随机挑选2只已造模的大鼠,断头处死后开腹显示病灶处均异位内膜体积增大,为直径5～8 mm的半透明囊肿,内有液体积聚,异位内膜有血管形成,提示造模成功。然后将造模大鼠随机分为B组、C组和D组,每组8只。

1.5 实验方法

A组常规饲养20 d,不作任何实验处理。

B组采用隔附子饼灸治疗。取关元穴[6],定位为大鼠脐下约25 mm,约在后肢根部与前正中线交点处。固定大鼠后,在穴位上放置附子饼,点燃艾炷后置于药饼上,共灸2壮。每日1次,7 d为1个疗程,疗程之间间隔3 d,共治疗2个疗程。

C组大鼠灌服达那唑溶液0.3 mL(含生药12 mg,以0.9%生理盐水溶解)。每日1次,7 d为1个疗程,疗程之间间隔3 d,共治疗2个疗程。

D组大鼠造模后固定于手术板上15 min,其间不作任何处理。每日1次,7 d为1个疗程,疗程之间间隔3 d,共治疗2个疗程。

1.6 观察指标

1.6.1 RT-PCR检测IL-4 mRNA、IFN-gmRNA表达

末次给药24 h后断头处死所有大鼠,在造模缝合处寻找异位内膜,仔细剪取异位内膜组织,放入液氮并转入-80℃冰箱。

采用Trizol一步法提取细胞总RNA。用DNA/RNA测定仪检测RNA浓度和纯度。取2mg总RNA,加入Oligo(dt)15引物及逆转录酶在25mg体积下,37℃、60 min完成逆转录反应后,进行聚合酶链反应。IL-4mRNA和IFN-gmRNA引物序列由上海生物工程公司根据GenBank序列设计合成。IL-4引物序列为,上游5’-GTATCCACGGATGTAACGACAGCC-3’,下游5’-AGCT TCTCTAGTGAGTTCAGACCGC-3’;IFN-g引物序列为,上游5’-GTATCCACGGATGTAACGACAGCC-3’,下游5’-GAGT TCATTGACAGCTTTGTGCTGG-3’;b-actin引物序列为,上游5’-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3’,下游5’- GCTCATTGCCGATAGTGATGACCT-3’。PCR反应条件为 94℃ 5 min,94℃ 30 s,45℃、72℃ 1 min,共35个循环,72℃ 10 min。不同引物最佳退火温度略有不同,b-actin 55℃,IL-4 56 ℃,IFN-g54 ℃。IL-4、IFN-g和b-actin扩增产物分别为294 bp、405 bp和630 bp。经2%琼脂糖凝胶电泳,利用MUVB-20凝胶分析系统(Ultralum)对扩增产物条带进行扫描,以IL-4/b-actin、IFN-g/b-actin的吸光度(A值)作为IL-4 mRNA和IFN-gmRNA表达的相对含量。

1.6.2 Western-blot检测p38MAPK的表达

取适量RIPA裂解液匀浆组织,测蛋白浓度后,各样品取50mg总蛋白上样电泳,根据蛋白分子量配制10%的PAGE胶电泳。取出凝胶根据Marker切下目的条带,用蒸馏水冲洗,剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸,PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。转膜条件为p38、p-p38 200 mA, 80 min。用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜,室温摇床封闭2 h。

一抗,用1:1000稀释封闭液稀释相应的一抗,使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4℃孵育过夜。二抗,TBST充分洗涤PVDF膜5～6次,5 min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗,以1:50000稀释,使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,室温摇床孵育2 h。显色曝光,TBST充分洗涤PVDF膜5～6次,5 min/次。每张膜滴加适量的ECL底物液,孵育数分钟。待荧光带明显后,用滤纸吸去多余的底物液,覆上保鲜膜,X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,采用单因素方差分析进行各组间数据比较。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR检测结果

表1 各组IL-4mRNA与IFN-gmRNA表达比较 (±s)

表1 各组IL-4mRNA与IFN-gmRNA表达比较 (±s)

组别nIL-4mRNA表达量IFN-gmRNA表达量 A组80.555±0.2461.684±0.415 B组8 1.603±0.2631) 0.685±0.3161) C组8 1.225±0.3281)2) 1.063±0.2331)2) D组8 0.920±0.2461)2) 1.219±0.3201)2)

注:与A组比较1)＜0.05,与B组比较2)＜0.05

与A组比较,B组、C组和D组大鼠的IL-4mRNA表达显著上升(均＜0.05);与D组比较,B组和C组大鼠的IL-4mRNA表达显著下降(均＜0.05);与C组比较,D组大鼠的IL-4mRNA表达下降,但两组比较差异无统计学意义(＞0.05)。与A组比较,B组、C组和D组大鼠的IFN-gmRNA表达显著下降(均＜0.05);与D组比较,B组和C组大鼠的IFN-gmRNA表达显著上升(均＜0.05);与C组比较,D组大鼠的IFN-gmRNA表达上升,但两组比较差异无统计学意义(＞0.05)。详见表1、图1和图2。

图1 各组IL-4电泳图

图2 各组IFN-g电泳图

2.2 Western-blot检测结果

与A组比较,B组、C组和D组大鼠磷酸化p38MAPK表达明显增高(均＜0.05);与D组比较,B组和C组大鼠磷酸化p38MAPK表达显著降低(均＜0.05);与B组比较,C组磷酸化p38MAPK的表达降低,但两组比较差异无统计学意义(＞0.05)。详见表2、图3。

表2 各组磷酸化p38MAPK的表达情况比较 (±s)

表2 各组磷酸化p38MAPK的表达情况比较 (±s)

组别np-p38/p38MAPK A组80.120±0.027 B组80.612±0.1231) C组80.429±0.1041)2) D组80.292±0.0841)2)

注:与A组比较1)＜0.05,与B组比较2)＜0.05

图3 各组p-p38MAPK电泳图

3 讨论

子宫内膜异位症是临床常见的良性妇科疾病,但具有浸润、转移及复发等恶性肿瘤特征[7],其发病机制尚不清楚。有研究[8]表明,在位内膜细胞出现黏附-侵袭-血管形成是EMs的基本病理变化。

p38MAPK是EMs发病机制中一条关键信号通路[9-12]。炎症因子等因素可以激活p38MAPK信号通路,进而作用于核转录因子,调控基因表达,介导炎症反应,参与异位子宫内膜的生成[8]。p38MAPK通路能诱导Th细胞发生Th1/Th2漂移,使得异位的子宫内膜细胞发生免疫逃逸现象,从而促进其种植与生长[13-16]。研究发现激活p38MAPK通路可促进GATA-3的磷酸化,进而可促使Th2细胞产生大量的IL-4等细胞因子[17]。有研究[4]发现,p38MAPK抑制剂可以阻断其表达与活性,能显著降低机体的炎症反应。

目前大多学者认为EMs患者机体的免疫抑制状态给异位的子宫内膜细胞侵袭与生长提供了有利的环境[3]。在EMs的免疫机制研究中已知T辅助细胞与子宫内膜的异位种植关系最为密切[18]。非特异性免疫不能清除脱落至盆腔后在位的内膜细胞。相反,它可以通过抗原递呈细胞激活以T细胞介导的细胞免疫。T辅助淋巴细胞(helper T cell, Th)是免疫应答中的关键细胞,因抗原特性、激素等因素的不同,可向Th1或者Th分化。前者主要分泌IL-2、IFN-g、IL-12等,介导细胞免疫应答,增强杀伤细胞的细胞毒性作用;后者以分泌IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子为主,介导体液免疫应答,促进B细胞增殖、成熟,促进抗体的产生[19]。Th1与Th2在正常机体中维持着动态平衡,当平衡状态被打破,即“Th1/Th2漂移”,便会导致机体产生自身免疫性疾病、炎症反应、肿瘤等[20]。研究表明,Th1和Th2在EMs妇女外周血和腹腔液中不平衡表达,其中Th1细胞群功能明显下降,Th2细胞因子水平普遍升高,由Th1向Th2型漂移,机体处于免疫抑制状态,这可能是EMs发生的始动原因[19]。IL-4是一种具有多种生物功能的细胞因子,其主要作用为促使原始的T细胞向Th2分化,其还可以抑制巨噬细胞功能,降低细胞毒性和抑制Th1型细胞的产生,高浓度的IL-4能阻止静止的T细胞分化为Th1细胞。而IFN-g是Th1的主要因子之一,对许多细胞的生长有着较强的抑制作用,其可直接促进T和B淋巴细胞的活化,从而加强细胞免疫,或者间接诱导TNF和IL-2的分泌增加来提高机体的免疫水平[21]。

中医学中虽无EMs此病名的记载出现,但有关“痛经”“癥瘕”“月经不调”“不孕”等病的描述却能符合EMs的绝大部分症状[22]。温通药物对EMs的治疗有着良好的效果[23]。隔药饼灸属于间接灸的一种,由附子、肉桂、丹参、红花、木香等药物配方制成药饼,能将艾灸、药物以及相应穴位的治疗作用结合起来。关元为小肠募穴,系足三阴、阳明、任脉、冲脉之会,任冲二脉皆起于胞宫,任脉为“阴脉之海”,冲脉为“血海”,该穴又位于脐下3寸,邻近胞宫,故亦为治疗EMs之要穴。艾炷与皮肤隔之以药饼,火力温和,艾灸和药物双重作用同时对腧穴进行刺激,产生艾灸生物效应,影响组织细胞代谢。

本实验结果显示,D组大鼠的IL-4mRNA表达显著上升,磷酸化p38MAPK表达明显增高,但D组大鼠的IFN-gmRNA表达显著下降,提示炎症因子等因素激活p38MAPK信号通路,促进IL-4等细胞因子表达,介导炎症反应,而Th细胞动态平衡被打破,Th细胞向Th2分化,IFN-g生成减少,大鼠机体处于免疫抑制状态。经过治疗之后,B组和C组大鼠的p38MAPK表达和IL-4mRNA表达均较D组显著下降,IFN-gmRNA表达显著上升,提示在关元穴上施隔药饼灸和达那唑均可以抑制p38MAPK信号通路,减少IL-4生成,IFN-g生成上升,Th细胞向Th1分化,Th细胞动态平衡有恢复趋势,但两者之间无显著性差异,提示隔药饼灸治疗和达那唑有相同效果。

综上所述,隔药饼灸能抑制p38MAPK信号通路,抑制IL-4的表达,促进IFN-g生成,诱导Th细胞向Th1分化,恢复Th细胞动态平衡。

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Intervention Effect of Herbal Cake Moxibustion on p38MAPK Signaling Pathway in Endometriosis Rats

1,1,-1,-2,-1.

1.,330004,; 2...,414017,

Objective To investigate the Intervention effect of herbal cake moxibustion on p38MAPK signaling pathways in endometriosis rats. Methods Thirty-four rats were randomized into group A (blank control) of 8 rats and a model group of 26 rats. A model of endometriosis was made in the model group. Two rats selected randomly from the model group were sacrificed to examine the result of model making. Rats with successful model making were randomized into group B (herbal cake moxibustion), group C (oral gavage of danazol solution) and group D, 8 rats each. Group A received herbal cake moxibustion on point Guanyuan; group B, an oral gavage of danazol solution; group C, no treatment. After 20 days, every group of rats was sacrificed and the experimental specimens were taken. The expressions of IFN-gand IL-4 in the specimen were determined by fluorescence quantitative PCR in every group. The expression of phosphorylated p38MAPK was determined by Western blot in every group. Results The expressions of IL-4 mRNA and phosphorylated p38MAPK increased significantly and IFN-gmRNA expression decreased significantly in groups B, C and D of rats compared with group A (all＜0.05). The expressions of IL-4 mRNA and phosphorylated p38MAPK decreased significantly and IFN-gmRNA expression increased significantly in groups B and C of rats compared with group D (all＜0.05). There were no significant differences in the expressions of phosphorylated p38MAPK, IL-4 mRNA and IFN-gmRNA between groups B and C (all＞0.05). Conclusions Herbal cake moxibustion can inhibit p38MAPK signaling pathways and IL-4 expression, promote IFN-gproduction, induce the differentiation of Th cells into Th1 cells and restore the dynamic balance of Th cells.

Acupuncture-moxibustion therapy; Endometriosis; Indirect moxibustion; Medicinal cake-partitioned moxibustion; p38MAPK signaling pathways; Th cell differentiation; Point, Guanyuan; Rats

1005-0957(2016)11-1348-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.11.1348

2016-04-01

江西省教育厅科技项目资助(GJJ11550)

覃肯(1988 - ),男,2013级硕士生

周志刚(1971 - ),男,副教授