芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

李信申,肖运萍,魏林根,黄瑞荣,华菊玲*

(1.江西省农业科学院 植物保护研究所,江西 南昌 330200;2.江西省农业科学院 资源与环境研究所,江西 南昌 330200)



芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究

李信申1,肖运萍2,魏林根2,黄瑞荣1,华菊玲1*

(1.江西省农业科学院 植物保护研究所,江西 南昌 330200;2.江西省农业科学院 资源与环境研究所,江西 南昌 330200)

将采自江西12个县(市)的芝麻青枯雷尔氏菌29株菌株分别人工接种到寄主植物番茄、茄子、马铃薯和烟草上，鉴定结果表明：全部菌株属于生理小种1；25株菌株属生化变种Ⅲ,3株属生化变种Ⅳ,1株为生化变种Ⅲ-1亚种。对致病力测定结果的聚类分析表明：来自进贤、都昌、南昌、樟树4个红壤旱地传统种植区的菌株致病力最强;来自鄱阳砂壤及潮洲地传统种植区的菌株致病力中等；来自其它6个区域的菌株致病力最弱。因此，江西芝麻青枯雷尔氏菌的致病力存在明显的分化现象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的重要因子。

芝麻;青枯雷尔氏菌;生理小种;生化变种;致病力分化

芝麻青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种土传病害,系我国南方芝麻生产的重要限制因子[1]。现有的全基因组测序研究结果表明,青枯雷尔氏菌的基因组由染色体(chromosome)和大质粒(megaplasmid)2个闭合环状复制子构成[2-3]。大质粒上除包含一些重要持家基因副本外,还携带了为数众多的菌株特有基因(strain-specific gene)和有助于提高病菌致病及适应能力的基因簇或遗传岛,如III型和VI型分泌系统、胞外多糖合成、鞭毛合成的基因簇等[2，4]。在分子进化过程中,青枯雷尔氏菌的染色体相对保守,而大质粒则更为活跃,其可变基因(variable gene)所占的比例高达63%[5]。青枯雷尔氏菌的这一遗传特性,使得其致病力及生化特性呈现丰富的多样性。研究青枯雷尔氏菌的生化特性和致病力分化可为作物抗病品种选育和病害的流行预测奠定基础。潘哲超等[6]、邓正平等[7]、何云昆等[8]、谢世勇等[9]、徐丽慧等[10]、吕志强等[11]、何自福等[12]先后研究了烟草、花生、桑及茄科作物青枯雷尔氏菌的生化特性和致病力分化,但目前尚未见芝麻青枯雷尔氏菌生化特性及致病力分化的研究报道。为此,笔者对江西芝麻青枯雷尔氏菌的生理小种、生化变种以及致病力分化进行了系统研究,以期为芝麻抗病资源筛选、抗病育种及病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试青枯雷尔氏菌菌株30株,其中来自江西省进贤、丰城、都昌、樟树、鄱阳五个芝麻主产县(市)的芝麻青枯病菌株有15株,来自其它7个县(区)的芝麻青枯病菌株有14株(表1)。R.solanacearum的标准菌株GMI 1000(生理小种1，分离自番茄)由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供。

1.2 生理小种的鉴定

鉴别寄主植物为番茄(早丰)、茄子(长虹茄子)、马铃薯(市售)和烟草(本生烟)。将供试菌株配成1×108CFU/mL的菌悬液；对番茄、茄子和马铃薯进行针刺接种，病情严重度分级标准参照任欣正等[13]。烟草过敏反应试验参照方中达[14]的方法进行。生理小种鉴定参照Hayward[15]和He[16]的划分标准。

1.3 生化变种的鉴定

生化变种测定方法参考French等[17]。

1.4 致病力测定及数据处理

供试芝麻品种为感病品种“中芝13”。在芝麻初花期进行针刺接种,每个处理接种10株苗。从接种后第7天开始,参照江西省地方标准DB36/T 879─2015分级标准进行病情调查,每隔10 d调查1次；在芝麻盛花后期各处理的病情基本稳定时,统计各处理的病情指数。采用卡方距离法计算各处理间的相似系数,用离差平方和法进行聚类分析[18 ]。

表1 供试芝麻青枯雷尔氏菌的来源

2 结果与分析

2.1 菌株的生理小种

针刺接种鉴定结果(表2)显示,29株芝麻青枯雷尔氏菌菌株与对照菌株GMI 1000均能侵染番茄、茄子和马铃薯这3种寄主植物。注射接种结果表明,上述分离菌株与对照菌株均可在烟叶上产生典型的深褐色坏死斑。根据Hayward和He的生理小种划分标准,这些菌株均属于生理小种1。

2.2 菌株的生化变种

29株供试菌株对三糖(乳糖、麦芽糖、纤维二糖)和三醇(甜醇、甘露醇、山梨醇)的碳源利用测定结果(表3)表明：Jsjx02、JSjx23、JSzs01等25株菌株对供试的6种碳源均呈阳性反应,属生化变种Ⅲ,占86.21%;JSjx11、JSzs19、JSnc05这3株菌株对3种糖呈阴性反应,属生化变种Ⅳ,占10.34%;菌株JSfy01仅对山梨醇呈阴性反应,定为生化变种Ⅲ-1亚种,占3.45%。

2.3 菌株的致病力分化

针刺接种试验结果表明,供试的29株青枯雷尔氏菌菌株均对芝麻具有致病力,但致病力强弱存在明显差异(表4)。聚类分析结果(图1)显示,上述29株菌株可聚类为3个组,第Ⅰ组共有13株菌株,来自进贤、南昌、丰城、樟树、都昌的菌株均聚在该组中。该组还可再分为2个亚组,A亚组7株菌株的致病力最强,其中来自进贤3株，丰城2株，樟树和南昌各1株;B亚组6株菌株的致病力次强,其中来自樟树和都昌各2株，丰城和南昌各1株。第Ⅱ组共有16株菌株。该组可再分为3个亚组,C亚组4株菌株的致病力中等,来自鄱阳3株,都昌1株;D亚组和E亚组分别有8株和4株菌株,这两个亚组的菌株的致病力均较弱,来自余干、分宜、九江等6个县(区)的菌株均聚类在这两个亚组中。

表2 29株芝麻青枯雷尔氏菌菌株生理小种鉴定结果

注：表中数据为病情严重度级别;“+”表示烟草过敏反应产生褐色坏死斑。

表3 29株芝麻青枯雷尔氏菌菌株生化变种鉴定结果

注：“+”表示阳性反应;“-”表示阴性反应。

表4 29株芝麻青枯雷尔氏菌菌株致病力测定结果

3 讨论

不同地理起源的青枯雷尔氏菌在与其寄主长期协同进化的过程中,演化出明显的生理分化和遗传多样性。根据其致病范围,可分为5个生理小种(race 1～5)。其中,寄主范围广泛的生理小种1是我国长江流域及其以南地区的优势菌系[19 ]。本研究对来自江西12个县(市)不同土壤类型、不同栽培季节及不同芝麻品种上的29株代表性菌株的生理小种鉴定结果证实了这一点。29株菌株的生化变种鉴定结果显示,生化变种Ⅲ菌群是诱发江西芝麻青枯病流行的优势种群,也是芝麻青枯病流行结构的主要组成部分。现有研究揭示,青枯雷尔氏菌生理小种1、生化变种Ⅲ可侵染茄子、花生、马铃薯、番茄、烟草等多种作物,因此,选择与非寄主作物进行合理轮作对芝麻及其它寄主作物青枯病的有效防控极为关键。

图1 29株芝麻青枯雷尔氏菌菌株 致病力测定结果的聚类分析

本研究测定了不同县(市)青枯雷尔氏菌对芝麻的致病力,结果表明,来自进贤、南昌、丰城、樟树四个县(市)的所有菌株以及来自都昌的2株菌株的致病力明显强于来自芝麻主产区之一的鄱阳及其它区域菌株的。影响青枯雷尔氏菌致病力分化的外在因子主要有寄主植物种类、品种抗性水平、土壤生态及耕作栽培制度(尤其是前茬作物) 等。进贤、丰城、都昌均属芝麻主产区,南昌县菌株采集地亦为芝麻传统种植区,这些区域多为排水不良的红壤旱地,且生产上芝麻大多与花生、番茄、茄子、马铃薯等青枯雷尔氏菌寄主作物轮作,这些因素必然对青枯雷尔氏菌的致病力分化产生定向诱导作用,导致强致病力菌株成为优势种群,从而致使这些区域芝麻青枯病连年严重发生。鄱阳虽亦属传统芝麻产区,但该区域大多为排水良好的砂壤地及潮洲地,且该区域为传统棉花产区,所以其菌株的致病力受到寄主植物及土壤生态的影响较小,因而菌株的致病力相对较低。在余干、分宜、九江等6个县(区),由于青枯雷尔氏菌菌株的致病力受到寄主植物及栽培制度的影响小,因而它们的致病力最弱。因此,从本研究结果可以得出:青枯雷尔氏菌与其寄主植物在长期互作中,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生态是影响青枯雷尔氏菌致病力分化的主要外在因子。

青枯雷尔氏菌的致病力分化不仅与植物种类、品种抗性水平、土壤生态及耕作栽培制度等外在因素有关,更与其内在的致病基因、调控因子,以及与寄主抗病基因的互作密切相关。先后完成的9个青枯雷尔氏菌基因组全序列分析结果也表明,青枯雷尔氏菌在寄主植物的致病过程中,通过启动复杂的全局调控网络,协调各类分泌系统适时组装以及各种毒性因子时序性表达和泌出,从而顺利完成侵染循环[20 ]。参与青枯病致病过程的分泌系统包括:Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型及双精氨酸转运分泌系统;致病因子主要包括脂多糖、胞外多糖、胞外蛋白以及Ⅲ型效应子等[21 ]。尤其是Ⅲ型分泌系统(T3SS)及其效应子(effector)是完成致病过程和参与寄主互作反应最为重要的决定因子[22 ]。因此,关于芝麻青枯雷尔氏菌的遗传谱型与致病力分化之间的关系还有待于进一步研究。

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(责任编辑:黄荣华)

Study on Biochemical Characteristics and Pathogenicity Differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom Sesame

LI Xin-shen1, XIAO Yun-ping2, WEI Lin-gen2, HUANG Rui-rong1, HUA Ju-ling1*

(1. Plant Protection Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, 330200, China; 2. Soil and Fertilizer & Resource and Environment Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

A total of 29 strains ofRalstoniasolanacearumisolated from sesame in 12 counties (cities) of Jiangxi Province were artificially inoculated into the host plants tomato, eggplant, potato and tobacco, respectively, and the classification results indicated that: all strains belonged to the physiological race 1; among them, 25 strains, 3 strains and 1 strain belonged to biovar Ⅲ, biovar Ⅳ and biovar Ⅲ-1, respectively. The clustering analysis of pathogenicity test results showed that: the strains isolated from sesame planted in red-soil dryland of Jinxian, Duchang, Nanchang and Zhangshu possessed the strongest pathogenicity; the strains from sesame planted in sandy loam soil and tidal sandy soil of Poyang possessed a middle pathogenicity; while those from other 6 regions had the weakest pathogenicity. Therefore, the pathogenicity differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom sesame in Jiangxi was obvious, and it was affected mainly by host plant, cropping system and soil ecology.

Sesame;Ralstoniasolanacearum; Physiological race; Biovar; Differentiation of pathogenicity

2016-10-18

国家自然科学基金项目(31360428);农业部公益性行业(农业)科研专项(201303015);江西省支撑计划项目(20121BBF60015)。

李信申(1980─),男,安徽蚌埠人,博士,从事植物病理学研究。*通讯作者:华菊玲。

S435.653

A

1001-8581(2016)12-0061-05