五子降糖方对原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的影响

周雪梅 石丽莉 李钰慧 李继安 田春雨 张碧溦 王晨斌 代春燕 焦如春 王 成 喇孝瑾

华北理工大学中医学院 河北唐山 063000;①唐山市妇幼保健院;②天津中医药大学



五子降糖方对原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的影响

周雪梅 石丽莉①李钰慧②李继安 田春雨 张碧溦 王晨斌 代春燕 焦如春 王 成 喇孝瑾

华北理工大学中医学院 河北唐山 063000;①唐山市妇幼保健院;②天津中医药大学

①目的 观察五子降糖方对骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响，探讨其改善胰岛素抵抗作用的可能机制。②方法 对骨骼肌细胞应用5×10-7mol/L胰岛素干预12小时建立胰岛素抵抗模型，应用低、中、高剂量(25μg/mL，100μg/mL，400μg/mL)五子降糖方对造模成功的骨骼肌细胞进行干预，同时设正常组、模型组，药物干预24小时后用葡萄糖氧化酶法测定骨骼肌细胞葡萄糖消耗量；③结果 五子降糖方各组与模型组比较葡萄糖消耗量高于模型组(P<0.01)，高剂量组与正常组比较，葡萄糖消耗量无统计学差异(P>0.05)，中剂量组与正常组比较，葡萄糖消耗量低于正常组(P<0.05)，低剂量组葡萄糖消耗量显著低于正常组(P<0.01)；④结论 五子降糖方可以改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的葡萄糖代谢。

五子降糖方 骨骼肌细胞 胰岛素抵抗 葡萄糖代谢

糖尿病是一种由遗传、环境等多种因素引发的慢性综合性疾病，该病主要表现为胰岛素相对缺乏或者绝对缺乏，也可能是周围靶组织对胰岛素敏感性降低，进而引发的以糖代谢紊乱为主，继发脂肪、蛋白质、电解质、水代谢紊乱综合征。近年来，随着生活水平的提高，糖尿病的发病率在世界范围呈上升趋势，尤其是在发展中国家，其增长速度更快，其中2型糖尿病患病率占患病总人数的90%以上。糖尿病严重危害人类健康，同时给社会医疗保障体系带来沉重的负担。前期实验研究表明，五子降糖方可以降低2型糖尿病大鼠空腹血糖和餐后2小时血糖，增加肝脏糖原含量，其机制可能与提高骨骼肌葡萄糖转运蛋白(GLUT4)表达水平、抗氧化、抗炎及改善胰岛β细胞功能，提高肝脏蛋白激酶B(AKT)及糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、丝氨酸位点磷酸化水平有关[1～3]。本实验通过取原代骨骼肌细胞，高胰岛素干预建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型，体外实验观察了五子降糖方对出现胰岛素抵抗的骨骼肌细胞葡萄糖代谢影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选取3～5天SD新生乳鼠，授赠于华北理工大学医学实验动物中心。

1.1.2 药物与试剂 五子降糖方由菟丝子、女贞子、紫苏子、莱菔子、车前子组成，购于北京同仁堂唐山连锁药店有限公司，DMEM高糖培养液(Gibco公司，批号：8115031)；无酚红DMEM高糖培养液(Gibco公司，批号：1042204)；胎牛血清(GEMINI公司，批号：A97D00E)；青/链霉素(HyClone公司，批号：J130054)；MTT试剂盒(碧云天生物技术研究所，产品编号：C0009)；葡萄糖测定试剂盒，(中生北控生物科技股份有限公司，批号：143331)；胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：1406219)。

1.1.3 主要仪器 BS224S精密电子天平(德国SARTORIUS公司)；GZX-9240数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；M200PRO酶标仪(瑞士TECAN公司)；生物安全柜(美国Thermo Scientific公司 )；CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物提取方法。五子降糖方按其组成药物菟丝子：女贞子：紫苏子：莱菔子：车前子(3:3:2:2:2)比例混合并粉碎成粗末，加8倍量水煎煮8小时，静置12小时后12000r/min离心取上清。

1.2.2 原代细胞取材与培养、诱导分化[4]。取3～5天SD乳鼠骨骼肌于培养皿，剪其肌肉为0.13cm小块，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗，剔除脂肪、结缔组织、骨骼，撕碎肌肉。将碎肌肉移至新的培养皿，PBS洗3次，静置后弃去上层液及漂浮组织。 向该培养皿中加入0.25%胰酶1mL、0.1%胶原酶IV 1mL，撕碎组织并反复吹打，显微镜下观察有肌肉细胞脱离组织后加入生长培养液终止消化。200目过筛，800r/min离心5分钟，弃上清夜，加入含10%胎牛血清(FBS)、1%青/链霉素的DMEM培养液6～8mL，移入培养瓶，在含5%CO2，37℃ 的CO2细胞培养箱中培养。

1.2.3 原代骨骼肌细胞造模及药物干预[5,6]。用差速贴壁法对原代骨骼肌细胞进行纯化，将第3代骨骼肌细胞按照2×104接种到96孔板中进行培养，待细胞长至70%时改用2%FBS、1%青/链霉素的DMEM培养液诱导分化，分化出肌管后将96孔板中的培养液倒掉。用PBS清洗3次，每孔加入含2%FBS、1%青/链霉素的无酚红DMEM的培养液180μL，加入胰岛素20μL。设不同胰岛素浓度组(5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9)mol/L，并设正常孔(不加胰岛素)。在干预12小时后测定骨骼肌细胞上清液的葡萄糖含量(按照试剂盒说明使用)，并采用MTT方法检测细胞活力，确定胰岛素造模浓度。骨骼肌细胞造模成功后用PBS清洗3次，加入含2%FBS、1%青/链霉素的无酚红DMEM培养液180μL，五子降糖方加20μL。五子降糖方分为低、中、高剂量组(25、100、400μg/mL)，同时设正常组，模型组，干预24小时后测定葡萄糖消耗量。

2 结果

2.1 原代骨骼肌细胞照片 采用酶消化法提取细胞，24小时换液后见图1，细胞已经贴壁，形状不规则，数量少。第三天细胞换液后见图2，细胞数量有所增长，生长走形及形状不规则。

图1 培养骨骼肌细胞24小时图片(×40)

图2 培养骨骼肌细胞72小时图片(×200)

表1 各组干预12小时后细胞上清葡萄糖含量及细胞活力比较

2.2 高胰岛素诱导骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型 不同浓度胰岛素作用于骨骼肌细胞12小时后测定细胞上清液葡萄糖含量。5×10-7mol/L、5×10-6mol/L、5×10-5mol/L浓度胰岛素组与正常组比较存在显著性差异(P<0.05)，其他组与正常组比较没有差异。不同浓度胰岛素作用于骨骼肌细胞12小时后检测细胞活力，5×10-7mol/L胰岛素组与正常组比较没有差异，对细胞活力没有影响，5×10-6mol/L，5×10-5mol/L浓度胰岛素干预后骨骼肌细胞活力有所下降，最终确定骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型造模浓度为5×10-7mol/L，见表1。

2.3 五子降糖方对骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖代谢的影响 五子降糖方对造模成功的骨骼肌细胞进行干预后测定葡萄糖消耗量，五子降糖方各组与模型组比较，葡萄糖消耗量均高于模型组且存在显著统计学差异(P<0.01)；与正常组比较五子降糖方高剂量组葡萄糖消耗量无统计学差异，中剂量组葡萄糖消耗量低于正常组(P<0.05)，低剂量组葡萄糖消耗量显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 五子降糖方各组对骨骼肌细胞葡萄糖消耗量的影响

3 讨论

2型糖尿病属中医消渴范畴，中医学认为本病是一种虚实夹杂的复杂症候，《灵枢五脏》云：“肾脆则善病消瘅，易伤”。《外台秘要·消渴消中门》强调：“消渴者，原其发动，此则肾虚所致，每发即小便至甜”，进一步说明肾亏是其患病的关键。《素问·通评虚实论》“消瘅……肥贵人，则膏梁之疾也”。《素问奇病论篇》云：“脾瘅，此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也……”则强调了过食肥甘厚味可致消瘅；由此可见，先天不足，气化不及与后天饮食肥甘太过是消渴病发病的主要因素。气化功能下降为发病之根，脂浊痰湿堆积为病之因，五子降糖方中菟丝子温补肾阳的同时平补肾阴，女贞子性凉，归肝肾经，具有滋补肝肾之阴的功效，二者合用，使肾之阴阳得补，肾气得充，进而蒸腾、气化推动和调节胃之“游溢精气”、脾之“散精”、肺之“通调水道”，使津液输布代谢正常，则痰浊无以内生。紫苏子降气消痰，莱菔子消食导滞、下气除痰，车前子泻而通之，泻有形之邪浊，涩中兼通，补而不滞。五药配伍使肾虚得补、气机得畅、痰浊得化。

骨骼肌是机体消耗葡萄糖的主要器官之一，胰岛素主要作用于肌肉、脂肪、肝脏，三者协调作用，维持动态平衡，一旦一方遭到破坏就会引起临床症状。胰岛素抵抗是指生理状态的胰岛素无法维持血糖正常水平，即靶组织对胰岛素敏感性降低，本实验以骨骼肌细胞为研究对象，建立高胰岛素诱导成胰岛素抵抗模型，应用五子降糖方对其干预，结果证明五子降糖方可以改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖代谢，实验具有科学性及合理性。

本实验选择出生3～5天SD乳鼠作为实验对象，实验过程中发现骨骼肌细胞传代次数有限，一般第6代之后活性开始减弱，之后逐渐失活。为保证本实验的合理性应用第2～3代原代细胞进行实验研究，可顺利进行实验。对生长出肌管的骨骼肌细胞应用不同浓度胰岛素干预12小时，5×10-7mol/L，5×10-6mol/L，5×10-5mol/L浓度胰岛素组与正常组比较存在显著性差异(P<0.05)，其他组与正常组比较没有差异。通过表1,最终确定了骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型胰岛素浓度为5×10-7mol/L。确定胰岛素造模浓度后可以对造模成功的骨骼肌细胞应用五子降糖方进行干预，五子降糖方组葡萄糖消耗量较模型组显著性高，五子降糖方高剂量组与正常组之间没有差异(P>0.05)，实验结果表明五子降糖方可以有效改善胰岛素抵抗的骨骼肌细胞的葡萄糖代谢，且改善作用具有剂量依赖性。该方发挥改善葡萄糖代谢作用的机制需在今后的实验中进一步研究。

[1] 王 亚,董玉山,喇孝瑾,等.五子降糖方对T2DM模型大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(16):193-196

[2] 王 亚,喇孝瑾,邱昌龙,等.五子降糖方对2型糖尿病模型大鼠肝组织糖原及AKT/GSK-3β信号通路的影响[J].北京中医药大学学报,2014,37(02):107-111

[3] 王 亚,高秀娟,贺宝玲,等.五子降糖方对T2DM大鼠血糖及血清SOD、MDA、hsCRP、C-P的影响[J].中华中医药杂志,2014,29(7):2367-2369

[4] 侯士方,孟 馨,相泓冰,等.大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定[J].实验室研究与探索,2011,30(04):26-28

[5] 杨 亮,迟 戈,张 俊,等.L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(2):248-251

[6] 马洁桃,张 岭,来伟旗,等.芒果苷对L6细胞葡萄糖消耗的影响及其作用机制研究[J].中国预防医学杂志,2012,13(09):662-666

(2016-02-20 收稿)(库雪飞 编辑)

Influence of insulin resistance of skeletal muscle cells with Wuzijiangtang formula

ZHOUXuemei,SHILili,LIYuhui,etal

(CollegeofTraditionalChineseMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the influence of insulin resistance skeletal muscle cells with Wuzijiangtang formula,to explore its mechanism in improving insulin resistance.Method With 5×10-7mol/L insulin intervention for 12h to built insulin resistant model.Application of Wuzijiangtang formula of high,middle and low concentrations(400μg/mL,100μg/mL,25μg/mL)on skeletal muscle cells that to set up skeletal muscle normal group and model group.Detected glucose content of cell supernatant with glucose oxidase method.Results Compared with model group,the glucose metabolism levels of Wuzijiangtang groups were higher(P<0.01).Wuzijiangtang formula high dose group compared with normal group had no significant difference(P>0.05).Wuzijiangtang formula middle dose group compared with normal group,the glucose metabolism levels were lower than normal group(P<0.05).Wuzijiangtang formula low dose group compared with normal group,the glucose metabolism levels were lower than normal group(P<0.01).Conclusion Wuzijiangtang formula can improve glucose metabolism.

Wuzijiangtang formula.Skeletal muscle cell.Insulin resistance.Glucose metabolism

河北省国际合作项目(编号：14397705D)；华北理工大学大学生创新计划。

周雪梅(1988-)，女，硕士研究生。研究方向：中医糖脂代谢疾病。

喇孝瑾。

R 581.3

A

2095-2694(2016)05-389-04