基于核糖体基因的灰树花分子系统关系分析*

杨 杨，郭 健，李长田

（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118）

基于核糖体基因的灰树花分子系统关系分析*

杨 杨，郭 健，李长田**

（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118）

为探讨灰树花的分子系统关系，通过PCR扩增获得灰树花（Grifola frondosa)18S rDNA、ITS rDNA序列，构建系统发育树，分析灰树花属级的亲缘关系，以及不同地域灰树花菌的种内遗传多样性。结果表明，灰树花起源于多孔菌科，ITS rDNA构建的系统发育树可以把来自亚洲和美国的菌株区分开，说明灰树花的地理距离和遗传距离存在一定的相关性，且灰树花可能为复合种群。

18S rDNA；ITS rDNA；系统发育；遗传多样性

灰树花 [Grifola frondosa(Dicks．Fr)S．F．Gray]，是一种重要的食（药）用菌，其味道独特鲜美且具有抗肿瘤、提高免疫力、降血压及抗病毒等多种药用价值。灰树花是木质腐生菌类，主要生长在栗树根部周围[1]，广泛分布于世界各地，如北美、日本、俄罗斯，中国的河北、长白山地区、浙江、广西、福建、四川、云南和西藏等地[2]。

依据分子系统发育关系，第十版《真菌字典》对多个真菌分类系统做出了调整，其中灰树花隶属于担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 多孔菌目（Polyporales） 亚灰树花菌科（Meripilaceae）树花属（Grifola）[3]。而在此之前，树花菌属被广泛认为属于多孔菌科（Polyporaceae）[4－5]。目前，国内外还未有文献报道过灰树花属的系统发育研究。

在真菌的分子系统发育研究中，核糖体基因是用于分子关系构建的主要研究序列。其中，RNA编码区（18S rRNA、5．8S rRNA、28S rRNA） 高度保守，多用于高级阶元间的比较；而内转录间隔区（ITS）进化速度最快，可用于区分种间及种内变异[6]。本研究在构建灰树花核糖体系统发育树基础上，比较分析灰树花种属关系，为研究灰树花属的系统关系与遗传多样性提供参考依据。

1　材料与方法

1.1菌株来源

本研究收集了全国各地以及来自日本和美国的共计26个灰树花菌株，见表1。

表1　灰树花菌株来源及编号Tab.1　Numbers and sources of Grifola frondosa

1.2总DNA的提取及PCR扩增

采用试剂盒（TakaraTM Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0） 法提取灰树花基因组DNA，选用引物ITS1和ITS4[7]、NS1和NS4[8]扩增灰树花ITS rDNA、18S rDNA序列。

PCR反应体系（50 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，DNA模板3 μL，ddH2O补充至50 μL。

扩增条件：94℃反应5 min；94℃反应 30 s，50℃反应30 s，72℃反应50 s，循环35次；72℃反应10 min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3序列比对和系统发育树的构建

使用Clustal X 1.83比对序列，人工检查校对。使用 MEGA 6.06软件构建灰树花与其相似属的18S rDNA ML（最大似然法）和ITS rDNA NJ（邻位相连法）系统发育树，使用jModelTest 2.1.7作为最适替代模型[9]，选择GTR+I+G作为最佳进化模型，Bootstrap自展值分析检验，重复1 000次，见表2、表3。

表2　本研究选用的18S rDNA序列Tab.2　18S rDNA sequences using in the study

2　结果与分析

本实验PCR扩增获得的灰树花18S rDNA基因序列长度为534 bp（GenBank登录号KX098283），与GenBank注册序列比对，平均长度533 bp，保守位点72个，变异位点444个，18S rDNA的G+C平均含量为44.9%。ML系统发育树见图1，灰树花ITS rDNA序列NJ亲缘关系树见图2。

在ML系统发育树中（图1），亚灰树花科与来自多孔菌科的真菌形成了3个独立分支，分支一包括灰树花属、亚灰树花菌属（Meripilus）、Rigidoporus、蜂窝菌属（Hexagonia）、小孔菌属（Microporus）和Abortiporus；分支二包括Physisporinus与多孔菌属（Polyporus），且具有较高的bootstrap支持；Abundisporus单独形成一个分支。结合子实体形态特征，发现与灰树花菌属亲缘关系相近的真菌多具有菌盖平展、孢子透明平滑的相似形态特征[10]。

表3　灰树花ITS rDNA序列Tab．3　ITS rDNA sequences of Grifola frondosa

图2　灰树花ITS rDNA序列NJ亲缘关系树Fig．2　NJ phylogenetic tree of Grifola frondosa based on ITS rDNA

本实验获得的灰树花ITS序列长度534 bp～544 bp（GenBank登录号：KX094522～KX094547），与GenBank注册序列比对，平均长度543 bp，保守位点315个，变异位点 208个，G＋C平均含量为51．4%。从ITS rDNA构建NJ系统发育树（图2）来看，来自美国的灰树花菌株H5和同样来自美国的菌株AY049127、AY049124位于同一分支中；来自庆元的菌株 H29与来自美国的菌株 AY049102、AY049104、AY049098、AY049137、AY049099位于同一分支；菌株H20和菌株H32在较高的支持下形成姐妹群，虽然来源地点不同，但在该分支中有较高的bootstrap支持。本实验收集的其他菌株来自日本和中国，与Genbank上找到的来自亚洲的菌株均在同一分支上。

3　结论与讨论

在18S系统进化树中，来自10个属的物种形成了3个独立分支，单系群Abundisporus[11]位于单独分支；隶属于亚灰树花菌科、多孔菌科、皱孔菌科和红褐拟层菌科（2个科曾隶属于多孔菌科[12]）的7个属8个物种位于分枝一中；分支二由亚灰树花菌科的Physisporinus和多孔菌科的多孔菌属构成。可见，亚灰树花菌科和多孔菌科在分枝一和分支二上均有分布，且在形态上具一定相似特征。从18S rDNA系统发育树看，亚灰树花科起源于多孔菌科，并未与多孔菌科具有明显的系统发育分歧，而多孔菌科是一个具有多元形态的类群[13]，其内部种属具有复杂的亲缘关系，应采用多基因比对，进一步划分该类群。

对于灰树花的种内分子关系，本研究的ITS序列NJ系统发育树的结果与Shen[14]的结果一致，来自美国的菌株H5同其他来自美国的菌株构成单独分枝，与其余来自亚洲的菌株区分开，因此，灰树花可能为复合种群。灰树花的地理距离和遗传距离存在一定的相关性，来自同一地域的大部分灰树花聚在相同或相近的分枝。而由于真菌具有孢子传播的特性，对于此两大来源的灰树花菌株间的遗传距离分析还应参考更多的其他来源菌株。

综上所述，对于灰树花的系统发育和遗传多样性研究还需了解更多地理区域的基因数据，从表型到DNA分子水平多层次的综合研究。

[1]纪天保.灰树花生态环境考察[J].中国食用菌，1995（1）：37.

[2]林章余，何锦星，林文忠.灰树花研究综述[J].福建农业科技，1994（6）：29-30.

[3]Kirk PM,Cannon PF,Minter DW,et al.Dictionary of the fungi(10th Edn)[M].UK,Wallingford:CABI Publishing,2008.

[4]Gilbertson RL,Donk MA,Gilbertson RL,et al.Check List of European polypores[J].Mycologia,1975,67(67):469.

[5]Zhao JD,Zhang XQ.The polypores of China[J].Bibliotheca Mycologica,1992(145):1-524.

[6]Sengupta J,Nilsson J,Gursky R,et al.Visualization of the eEF2-80S ribosome transition-state complex by cryo-electron microscopy[J].Journal of Molecular Biology,2008,382(1): 179-187.

[7]陈凤毛.真菌ITS区序列结构及其应用[J].林业科技开发，2007，21（2）：5-7.

[8]Gildemacher P,Heijne B,Silvestri M,et al.Interactions between yeasts,fungicides and apple fruit russeting[J].Fems Yeast Research,2006,6(8):1149-1156.

[9]Posada D.jModel test:phylogenetic model averaging[J]. Molecular Biology&Evolution,2008,25(7):1253-1256.

[10]赵继鼎，张小青，许连旺.中国真菌志·第三卷·多孔菌科[M].北京：科学出版社，1998

[11]Zhao CL,Chen H,Song J,et al.Phylogeny and taxonomy of the genus Abundisporus(Polyporales,Basidiomycota)[J]. Mycological Progress,2015,14(6):1-17.

[12]Hawksworth DL,Sutton BC,Ainsworth GC.Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the fungi(Seventh Edition)[M]. Ainsworth&Bisbys Dictionary of the Fungi Seventh Edition, 1983.

[13]赵继鼎，徐连旺，张小青.中国多孔菌属分类研究兼论本属分类位置[J].微生物学报，1981（4）：428-437.

[14]Shen Q,Geiser DM,Royse DJ.Molecular phylogenetic analysis of Grifola frondosa(maitake)reveals a species partition separating eastern North American and Asian isolates[J]. Mycologia,2002,94(3):472-482.

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中国食用菌杂志编辑部2016年11月10日

Molecular Phylogenetic Relationships of Grifola frondosa Based on Ribosomal Genes

YANG Yang,GUO Jian,LI Chang-tian
(Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi，Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China)

The molecular phylogenetic relationships of Grifola frondosa were analysed by phylogenetic trees which were obtained by 18S rDNA and ITS rDNA sequences amplificated using PCR．The results suggested that G.frondosa originated from Polyporaceae,and the phylogenetic tree based on ITS rDNA could isolate the strains form Asia and the United States．G.frondosa may be composite groups,and there is a certain correlation between the geographical distance and genetic distance．

18S rDNA;ITS rDNA;phylogeny;genetic diversity

S646.9

A

1003-8310（2016）06-0042-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．010

“十二·五”国家科技支撑计划课题（2013BAD16B05）；吉林省财政厅科研育种项目（201305）。

杨杨（1991－），女，在读硕士研究生，主要研究方向为菌物生态学。E－mail:keirayang02＠gmail．com

**通信作者：李长田（1970－），男，博士，教授，主要从事食用菌栽培研究。E－mail:changtianli＠126．com

2016－09－20