吗啡对人食管癌细胞Ec109生长及p53、caspase-3基因表达的影响

南振华 潘灵辉

吗啡作为阿片类强效镇痛药，被广泛应用于临床麻醉及癌性疼痛治疗。近年来，吗啡在癌痛镇痛的应用过程中是否促进癌细胞生长、凋亡及其相关作用机制已成为研究的热点之一［1～3］。因此，本研究旨在探讨吗啡对人食管癌Ec109细胞增殖的影响及吗啡调控食管癌Ec109细胞生物行为的相关机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

人食管癌细胞株Ec109由广西肿瘤防治研究所实验室提供；临床用吗啡注射液购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO购自美国Gibco公司；CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒购自日本同仁公司；细胞周期和凋亡试剂盒购自美国BD公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；PCR引物、反转录试剂盒和RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；Prism7300实时定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 人食管癌细胞株Ec109培养于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的 RPMI-1640 培养基中，置于 37°C、5%CO2、95%湿度细胞培养箱，细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化传代，2～3 d传一代。取对数生长期的细胞，将Ec109细胞分为对照组和实验组，根据Qin等［1］的研究选取吗啡作用浓度，将实验组又随机分为3个亚组：M1组（0.1 μmol/L）、M2组（10 μmol/L）、M3组（1 000 μmol/L）；对照组加入等容量的RPMI-l640培养基，每组实验重复6次。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制情况 取对数生长期的Ec109细胞制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至 1.5×104个/mL，将悬液以 100 μL/孔接种于 96 孔板中。24 h细胞贴壁后，加入含吗啡且终浓度分别为0.1 μmol/L、10 μmol/L、1 000 μmol/L 的新培养液 100 μL，同时设不用药孔。培养至24 h、48 h、72 h时，每孔分别加入10 μL的 CCK-8继续培养3 h，取出培养板，酶标仪测定450 nm处的吸光度A值，每孔测量3次，取其平均值，计算抑制率。抑制率（%）=［1-（A给药组-A空白孔）/（A对照组-A空白孔）］×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 收集经不同浓度吗啡作用48 h后的Ec109细胞，PBS洗涤2次，调整待测细胞至其密度为1×106个/mL。每个样本取1 mL细胞，1 000 r/min离心5 min收集细胞，加入冷PBS使细胞悬浮，再次离心后将细胞重悬于100 μL的结合缓冲液中，依次加入5 μL Annexin V和5 μL PI，轻轻混匀，避光下室温放置15 min。加入400 μL结合缓冲液，立即上机检测，采用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期情况 收集经不同浓度吗啡作用48 h后的Ec109细胞，PBS洗涤2次，每个样本细胞总数为2×106个，1 000 r/min离心5 min收集细胞，加入冰浴预冷PBS洗涤1遍，细胞沉淀加入1 mL预冷后的70% 乙醇，混匀，4°C固定过夜。上机前，1 200 r/min离心4 min弃上清液，再加入1 mL预冷后的PBS洗涤一遍后，加入40 μLRNaseA，37°C 避光温浴 30 min，每管加入 200 μL PI，避光染色20 min，1 h内上机检测。

1.2.5 RT-PCR检测细胞p53和casepese-3基因表达情况 收集各组作用48 h后的Ec109细胞，用Trizol法提取RNA，按照反转录试剂盒说明反转录为cDNA。4倍浓度梯度稀释模板cDNA并制作标准曲线，确定基因的扩增效率，确定cDNA上样浓度，逆转录产物作为下一步PCR模板。PCR引物设计：p53上游引物为 5′-CTGGCCATGAACTACCTGGA-3′，下游引物为 5′-GTCACACTTGATCACTCTGG-3′，483 bp；caspase-3上游引物为 5′-CTGCCGGAGTCTGACTGGAA-3′，下游引物为 5′-GTCGGCCTCCACTGGTAT CT-3′，136 bp；β-actin上游引物为 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游引物为 5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，308 bp。PCR 反应条件：预变性 95°C 30 s，变性95℃5 s，60℃ 30 s退火及延伸，循环 40次。以β-actin作为内参。采用2-△△Ct法计算相对表达量。对照组p53 mRNA和caspase-3 mRNA的转录水平均设为1。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吗啡对食管癌Ec109细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，实验组M1组、M2组、M3组的细胞增殖抑制率均高于对照组，各实验组分别与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；随着吗啡浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率升高，且呈明显的时间和浓度依赖性（P＜0.01）。见表1。

表1 不同浓度吗啡对食管癌Ec109细胞增殖抑制的影响［（±s）%］

表1 不同浓度吗啡对食管癌Ec109细胞增殖抑制的影响［（±s）%］

与对照组比较，*P＜0.01。

组别作用时间24 h 48 h 72 h对照组 - - -M1组 15.12±1.35* 20.72±1.51* 28.08±2.09*M2组 19.83±1.67* 26.21±2.18* 35.85±2.45*M3组26.41±2.21* 34.86±3.32* 44.48±3.41*

2.2 吗啡对食管癌Ec109细胞凋亡的影响

不同浓度吗啡作用48 h后，流式细胞仪检测结果显示，实验组M1组、M2组、M3组细胞凋亡率分别为（11.32±1.13）%、（15.12±1.83）%和（20.21±2.43）%，均高于对照组的（4.81±0.62）%，各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；随着吗啡作用浓度增加，食管癌Ec109细胞凋亡率升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。见图1。

2.3 吗啡对食管癌Ec109细胞周期的影响

不同浓度吗啡作用48 h后，流式细胞仪检测结果显示，实验组M1组、M2组、M3组G1期细胞百分比均高于对照组（P＜0.05），且随着吗啡作用浓度的增加，G1期细胞比例升高，呈浓度依赖性（P＜0.05）。各实验组S期和G2/M期细胞百分比均低于对照组（P＜0.05），提示吗啡可使食管癌Ec109细胞阻滞在G1期。见表2。

图1 不同浓度吗啡作用食管癌Ec109细胞48 h后的细胞凋亡情况

表2 不同浓度吗啡作用食管癌Ec109细胞48 h后的细胞周期情况［（±s）%］

表2 不同浓度吗啡作用食管癌Ec109细胞48 h后的细胞周期情况［（±s）%］

与对照组比较，*P＜0.05。

组别 G0/G1期 S期 G2/M期对照组 47.82±2.81 34.56±2.8 18.31±1.3 M1组 58.37±2.14* 27.21±1.6* 15.63±1.65*M2组 67.42±2.71* 20.01±1.49* 13.06±1.2*M3组 77.73±3.95* 14.86±1.62* 9.21±1.13*

2.4 吗啡对食管癌Ec109细胞p53和caspase-3基因表达的影响

不同浓度吗啡作用48 h后，RT-PCR检测结果显示，实验组M1组、M2组、M3组p53基因的相对表达量分别为 1.39±0.11、1.75±0.16 和 2.11±0.21，均大于对照组，各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；实验组 M1组、M2组、M3组caspase-3基因的相对表达量分别为 1.58±0.09、2.04±0.12 和 2.85±0.21，均大于对照组，各实验组与对照组比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。随着吗啡作用浓度的增加，p53 mRNA和caspase-3 mRNA的表达量升高，呈浓度依赖性（P＜0.05），提示吗啡可上调p53和caspase-3基因的表达。见图2。

图2 不同浓度吗啡作用食管癌Ec109细胞48 h后p53和caspase-3 mRNA的表达量

3 讨论

吗啡可以激活神经元阿片受体信号产生强烈的镇痛作用，是癌症治疗中第三阶梯镇痛用药。除已知的镇痛作用外，近年来吗啡与肿瘤细胞生长的关联性越来越受到关注。多项研究证实，吗啡可通过ErbB信号网络的重排、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）和c-Jun氨基端激酶（JNK）的激活等多种途径抑制肿瘤细胞增殖［3～5］。另有研究表明，吗啡可以阻止乳腺癌MCF-7细胞和结肠癌HT-29细胞进入S期，使其细胞周期阻滞在G1期，进而抑制细胞的增殖［6］。但目前吗啡对食管癌细胞的影响鲜有报道，本研究以食管癌Ec109细胞为研究对象，观察吗啡对其生长的抑制作用，结果显示，不同浓度吗啡对食管癌Ec109细胞的增殖均有抑制作用，且随着药物作用浓度的增加和作用时间的延长，吗啡对细胞增殖的抑制作用亦增强，呈明显的浓度和时间依赖性。同时流式细胞仪检测结果显示，不同浓度吗啡均可促进食管癌Ec109细胞发生凋亡并使细胞周期阻滞在G1期，且随着药物作用浓度的增加，吗啡对细胞凋亡的促进作用和对细胞周期的阻滞作用增强，呈明显的浓度依赖性，与上述报道结果一致，但其具体作用机制尚未明确。

p53是重要的抑癌基因，50%以上的肿瘤组织中均发现p53基因突变，它是肿瘤中最常见的遗传学改变，可调控下游多种基因的表达［7，8］。研究表明，吗啡可上调p53在乳腺癌细胞和神经干细胞中的表达，并促进细胞发生凋亡［6，9］。p53基因突变在人食管癌的发生、发展中亦起重要作用［10］。caspase-3是caspase酶系家族的成员之一，是一种半胱氨酸基天冬氨酸基-特异性蛋白水解酶，广泛表达于人体正常组织及多种肿瘤组织，是细胞凋亡的主要执行者［11］。研究表明，吗啡在神经上皮瘤细胞和神经干细胞中均可使凋亡蛋白酶caspase-3发生活化，并促使细胞发生凋亡［4，12］。为进一步阐明p53和caspase-3基因与吗啡抑制食管癌细胞增殖及促进其凋亡之间的联系，本研究采用不同浓度吗啡作用食管癌Ec109细胞48 h后，采用RT-PCR检测p53和caspase-3基因的表达，结果发现各实验组p53和caspase-3基因表达量均较对照组明显升高，并呈浓度依赖性，与上述研究结果一致。因此推测吗啡可能通过上调抑癌基因p53和凋亡基因caspase-3的表达而抑制食管癌细胞增殖及促进其凋亡，并使细胞阻滞在G1期。

综上所述，本研究通过体外实验证实吗啡可抑制食管癌Ec109细胞增殖，促进细胞凋亡，使细胞阻滞在G1期，其作用机制可能是通过促进p53和caspase-3基因表达，然而在临床应用中吗啡对食管癌的抑制作用仍需要进一步研究。

［1］Qin Y，Chen J，Li L，et al.Exogenous morphine inhibits human gastric cancer MGC-803 cell growth by cell cycle arrest and apoptosis induction［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（4）：1377-1382.

［2］Polanco MJ，Alguacil LF，González-Martín C.Pro-apoptotic properties of morphine in neuroblastoma ×glioma NG108-15 hybrid cells：modulation by yohimbine［J］.J Appl toxicol，2014，34（1）：19-24.

［3］Weingaertner IR，Koutnik S，Ammer H.Chronic morphine treatment attenuates cell growth of human BT474 breast cancer cells by rearrangement of the ErbB signalling network［J］.PLoS One，2013，8（1）：e53510.

［4］Lin X，Wang YJ，Li Q，et al.Chronic high-dose morphine treatment promotes SH-SY5Y cell apoptosis via c-Jun N-terminal kinase-mediated activation of mitochondria-dependent pathway［J］.FEBS J，2009，276（7）：2022-2036.

［5］Yin D，Woodruff M，Zhang Y，et al.Morphine promotes Jurkat cell apoptosis through pro-apoptotic FADD/P53 and anti-apoptotic PI3K/Akt/NF-kappaB pathways［J］.J Neuroimmunol，2006，174（1-2）：101-107.

［6］Tegeder I，Gr sch S，Schmidtko A，et al.G protein-independent G1cell cycle block and apoptosis with morphine in adenocarcinoma cells：involvement of p53 phosphorylation［J］.Cancer research，2003，63（8）：1846-1852.

［7］Cao ZG，Xu X，Xue YM，et al.Comparison of 4-hydroxynonenal-induced p53-mediated apoptosis in prostate cancer cells LNCaP and DU145［J］.Contemp Oncol，2014，18（1）：22-28.

［8］Inoue K，Kurabayashi A，Shuin T，et al.Overexpression of p53 protein in human tumors［J］.Med Mol Morphol，2012，45（3）：115-123.

［9］Shoae-Hassani A，Sharif S，Tabatabaei SA，et al.Could the endogenous opioid，morphine，prevent neural stem cell proliferation?［J］.Med Hypotheses，2011，76（2）：225-229.

［10］Mandard AM，Hainaut P，Hollstein M.Genetic steps in the development of squamous cell carcinoma of the esophagus［J］.Mutat Res，2000，462（2-3）：335-342.

［11］Porter AG，J nicke RU.Emerging roles of caspase-3 in apoptosis［J］.Cell Death Differ，1999，6（2）：99-104.

［12］Willner D，Cohen-Yeshurun A，Avidan A，et al.Short term morphine exposure in vitro alters proliferation and differentiation of neural progenitor cells and promotes apoptosis via mu receptors［J］.PLoS One，2014，9（7）：e103043.