响应面法优选黄芩芍药汤提取工艺

张 莉 朱玮亚

（昆明医科大学海源学院机能学实验室，昆明650106）

响应面法优选黄芩芍药汤提取工艺

张 莉 朱玮亚*

（昆明医科大学海源学院机能学实验室，昆明650106）

目的优选黄芩芍药汤药提取工艺。方法以提取次数、提取时间、加水量为自变量，以黄芩苷、芍药苷含量综合评分为响应值，采用Box-Behnken响应面法优选提取工艺参数。结果最佳工艺条件为10倍量50%乙醇混合提取2次，每次1.0 h。结论优选的提取工艺稳定、可行。

药对；黄芩；白芍；混合提取工艺；响应面法

黄芩芍药汤源自《伤寒论》，处方由黄芩、白芍、甘草、大枣组成。方中黄芩苦寒，清热止利；芍药味酸，敛阴和营止痛；甘草、大枣和中缓急。诸药合用，共奏清热止利，和中止痛之功。黄芩、白芍为处方中的主药，黄芩和白芍单独提取工艺的研究多见于文献[1-4]，而黄芩与白芍混合提取工艺的研究报道较少。

目前响应面法已经广泛应用于中药提取工艺研究[5-8]，该方法通过对响应值和响应因素之间进行非线性的多元多次回归；通过拟合方程进行优化，并且可以对模型的可靠程度进行检测，更加适合中药制剂生产当中多指标、复杂成分提取工艺的优选。本研究拟使用响应面法优选黄芩芍药汤的提取工艺，为经方黄芩芍药汤的开发打下基础。

1 仪器和试药

1.1 仪器LC-2010A高效液相色谱仪（CLASS-VP数据处理系统，二极管阵列检测器，BS 210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；METTLERAE240型十万分之一电子天平（瑞士）；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4电子恒温不锈钢水浴锅（上海东星建材试验设备有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110736-201035）；黄芩苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号110715-200212）；甲醇(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司，批号110901)；磷酸二氢钾（分析纯，广州化学试剂厂，批号21100621）。

1.3 饮片白芍、黄芩、大枣、甘草饮片均购自昆明菊花园中药材专业市场。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件AgilentTC-C18(2)(4.6×250 mm)；以甲醇∶水∶醋酸（35∶64∶1）为流动相；检测波长：244 nm；柱温：30℃；流速为1 mL·min-1。理论塔板数以黄芩苷、芍药苷计均大于2000。

2.2 混合对照品溶液制备精密称取黄芩苷对照品3.46 mg、芍药苷3.02 mg分别置于25 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀后取等体积混合（黄芩苷0.0692 mg·mL-1、芍药苷0.0604 mg·mL-1）。

2.3 供试品溶液制备称取黄芩、白芍、甘草、大枣粗粉各3 g，按照正交实验设计的条件进行提取，每次提取后离心（4000 r·min-1，5 min）取上清液定容至250 mL容量瓶中，再精密量取1 mL定容至50 mL容量瓶中，色谱甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备取混合对照品溶液分别进样1 μL，3 μL，5 μL，7 μL，9 μL，测定峰面积值，并以进样量(x)对峰面积值(y)回归，结果表明在芍药苷

在0.0604~0.5436 μg范围内线性关系良好，标准曲线为：y=802469.4x+1014.8，r=1.0；黄芩苷在0.0692~ 0.6228 μg线性关系良好，标准曲线为：y=1437518x+ 16081.9，r=0.9999。

2.4.2 精密度试验取混合对照品溶液，重复进样5次，每次5 μL，计算峰面积积分值，黄芩苷RSD为2.79%；芍药苷RSD为2.02%，结果表明精密度良好。

2.4.3 稳定性试验取样品1份，精密称定，按照供试品溶液的制备方法制备，分别放置0 h，2 h，4 h，6 h，8 h后进样，进样量为10 μL，积分色谱峰峰面积，计算黄芩苷、芍药苷含量变化情况，黄芩苷RSD为2.45%，芍药苷RSD为2.56%，结果表明样品在8 h内稳定。

2.4.4 重复性试验取同一批样品5份，按照供试品溶液的制备方法制备，分别进样10 μL，积分色谱峰峰面积，计算得黄芩苷平均含量为15.80%，RSD为2.96%；芍药苷平均含量为3.05%，RSD为2.24%，表明重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验精密称定已知黄芩苷、芍药苷含量的样品粉末6份，每份各0.12 g，每两份分别加入黄芩苷对照品溶液（12.70 mg.mL-1）1.2 mL，1.5 mL，1.8 mL，芍药苷对照品溶液（1.21 mg.mL-1）2.4 mL，3.0 mL，3.6 mL，10倍量水提取两次，每次1.5 h，提取后离心（4000 r·min-1，5 min）取上清液定容至250 mL容量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，分别进样10 μL，计算加样回收率，结果见表1。

表1 黄芩苷、芍药苷加样回收率试验结果（n=6）

2.5 提取工艺优选在预实验的基础上，以醇浓度、溶剂用量、提取时间为自变量，以黄芩苷、芍药苷含量综合评分为响应值，设计三因素三水平中心复合实验，因素水平表见表2。按照实验设计方案混合提取黄芩白芍汤，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定黄芩苷、芍药苷含量，实验安排及结果见表3；采用Design Expert 8.06软件对所得的数据进行回归分析，结果见表2。

表2 提取工艺中心复合实验因素水平

2.5.2 正交试验结果取9份样品，按照正交试验设计表中的方法水浴回流提取，以黄芩苷、芍药苷含量权重系数分别为0.5计算综合评分为响应值为指标，分析乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数对实验结果的影响，结果见表4。

表3 响应面实验方案及分析结果(%)

表4 回归系数的显著性检验

2.2.2 建立模型方程及响应面分析Design Expert 8.06软件拟合得黄芩苷和芍药苷的综合评分对加水量、提取时间、提取次数的二次多项回归方程为：Y=89.44+ 1.46A-2.68B+11.79C-0.96AB-0.77AC-2.28BC+0.70A2-3.38B2-5.75C2。

由表3可知模型回归P值＜0.0001，说明模型回归显著可靠；失拟误差P值为23.42＞0.59，说明失拟度不明显；相关系数R2=0.9758，调整值为0.9446，说明该方程拟合度较高，该模型可以预测黄芩汤药汤混合提取工艺过程。根据二次多项式方程，分别绘制各指标与响应值交互项的响应曲面图，用来确定各因素对黄芩汤药汤提取工艺综合评分的影响，结果见图1～图3。

图1 加水量、提取对黄芩白芍汤药对提取综合评分交互影响的三维响应面图

图2 加水量、提取次数对黄芩白芍汤药对提取综合评分交互影响的三维响应面图

图3 提取时间、提取次数对黄芩白芍汤药对提取综合评分交互影响的三维响应面图

从图4～6的等高线形状可看出，提取时间、浸泡时间、加水量相互之间的交互作用不显著；根据等高线密度变化提取次数对黄芩汤提取综合评分影响提取时间、加水量大，对黄芩芍药汤提取综合评分具有显著影响（P＜0.01）。

2.2.3 提取条件优化根据Design Expert 8.06软件分析黄芩芍药汤药对提取综合评分最佳提取工艺条件为：加水量11.94倍，提取时间1.03，提取次数2.99次，黄芩芍药汤的理论提取综合评分为98.943。结合实际生产确定优化提取工艺为12倍加水量提取三次，每次1 h。

2.4 验证性试验取3批样品，按照优选的提取工艺进行提取，计算平均黄芩芍药汤提取综合评分为98.236 ml，RSD值为1.32%，与预测值偏差较小，说明优选的提取工艺稳定可靠。

3 讨论

有文献报道[9]芍药苷在高温煎煮过程当中所含的苯甲酸酯键，受热易分解或受其它成分干扰，含量会下降。本实验过程发现，煎煮时间增长，反而不利于芍药苷的提取，可能正是芍药苷分解引起的。运用HPLC同时测定黄芩、白芍中黄芩苷、芍药苷含量，测定方法的方法学考察结果表明该方法准确、可靠，可以作为黄芩苷、芍药苷含量同时测定的方法。中药提取工艺研究中许多为多种中药饮片一起提取，采用多指标评价，所优选的提取工艺可以节约成本、提高效率。本研究对黄芩芍药汤的提取工艺进行研究，为经发的开发打下基础。

[1]王帆，桂双英，王举涛.正交试验法优选复方白芍颗粒提取工艺[J].安徽中医学院学报，2007，31(6):72-73.

[2]高秀强，刘敏彦，宋剑，等.白芍中白芍总苷提取工艺研究[J].中国药业，2008，17(15):55-57.

[3]吴增宝，陈国良，吴亮.三黄片中黄芩苷提取工艺的实验研究[J].中医药临床杂志，2012，24(8）:779-780.

[4]施春阳，齐香君，钱卫东.黄芩毛状根中总黄酮的提取工艺[J].陕西科技大学学报，2013，31（2）：105-108.

[5]徐蓉，陈钧，徐骅，等.响应面法优化黄连黄柏中总生物碱的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2009，15(9):26．

[6]蒋志华，俞力超，冯子旺，等.响应面法优化仙鹤草总黄酮的超声提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（20）:17-20.

[7]符少莲，冯翠娟，李沙.星点设计-效应面法优化脂溶性丹参提取物速释滴丸处方工艺[J].中成药，2013，35(4):690-695.

[8]李玄，沙跃，张宇燕，等.响应面分析法优化脑络安胶囊提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(15):11．

[9]闫兴丽，张建军，李小燕，等.温度对白芍药材、白芍提取物及乾坤清颗粒成品中芍药苷含量稳定性的影响[J].中草药，2003，34(2):131-132.

Extraction Technology of Huangqin Shaoyao Decoction by Using Box-Behnken Response Surface Method

ZHANG Li,ZHU Weiya*
(Haiyuan College,Kunming Medical University,Kunming 650106,China)

Objective To optimize extraction technology of Huangqin Shaoyao decoction.Methods The contents of baicalin,paeoniflorin as indicators,we used orthogonal methods to investigate the influence of extraction times,extraction time,the amount of solvent, ethanol concentration on the Scutellaria baicalensiss,Radix Paeoniae Alba extraction technology.Results The optimum conditions were 10 times the amount of 50%ethanol extraction two times,with 1.0 h in each time.Conclusion The optimized process condition was scientific,stable and feasible.

couplet medicines;Scutellaria baicalensiss;Radix Paeoniae Alba;hybrid extraction technology;response surface method

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.21.058

1672-2779（2016）-21-0132-03

：李海燕本文校对：冀新威

2016-06-27）

*通讯作者：86640282@qq.com