片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其机制研究

冯健愉，靳祎祎，严兆坤，赖子君，彭军，林久茂

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

片仔癀抑制淋巴管新生的作用及其机制研究

冯健愉1，2，靳祎祎1，2，严兆坤1，2，赖子君1，2，彭军1，2，林久茂1，2

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122）

目的研究片仔癀（PZH）体外对淋巴管新生的抑制作用及其机制。方法体外培养人淋巴内皮细胞（HLEC），分成对照组及PZH低、中、高剂量组，倒置显微镜观察细胞形态变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；Transwell观察细胞迁移；Tube Formation观察细胞管腔形成；W estern Blot检测细胞促淋巴管新生相关因子蛋白表达。结果PZH低、中剂量组对HLEC的细胞形态、周期、凋亡无明显影响，而PZH高剂量组具有降低细胞密度、诱导HLEC凋亡、增加G0／G1期细胞比例和降低S期细胞比例的显著作用（P＜0.05）；PZH可显著降低HLEC的迁移能力和管腔形成能力，且呈现一定的剂量依赖；PZH明显下调HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10的蛋白表达（P＜0.05）。结论PZH体外对HLEC的淋巴管新生有显著抑制作用，通过抑制VEGFC、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10等表达是其抑制淋巴管新生的重要作用机制。

片仔癀；淋巴内皮细胞；淋巴管新生

淋巴管新生（lymphangiogenesis）是肿瘤发生转移的重要机制［1］，受到多种因子的调控，其中血管内皮生长因子C（VEGF-C）及其受体VEGFR-3和基质金属蛋白酶家族蛋白可抑制淋巴内皮细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移及其管腔形成，并最终导致淋巴管新生［2-3］。抑制淋巴管新生已成为一种极具潜能的肿瘤治疗策略。片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）对多种恶性肿瘤的临床疗效显著，且无明显毒副作用［4］。实验研究显示：PZH可诱导大肠癌细胞凋亡，抑制大肠癌细胞增殖、转移、耐药及肿瘤血管新生等［5-8］，但未见从淋巴管新生方面探讨PZH抑制肿瘤转移的研究报道。本课题组开展了初步的研究，现报告如下。

1材料

1.1 药物和细胞株PZH由漳州片仔癀药业股份有限公司提供（生产批号：1009039）；人淋巴内皮细胞（HLEC）购自广州吉尼欧生物科技有限公司。

1.2 试剂与耗材RPIM 1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-链霉素混合液（双抗，美国Thermo公司）；AnnexinⅤ-FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期即时检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；Transwell板（美国Corning公司）；管腔形成试剂盒（德国Merck Millipore公司）；抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；培养瓶、培养板（无锡耐思生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；倒置显微镜系统（德国Leica仪器有限公司）；流式细胞仪（FCM，美国BD公司）；Trans-Blot小型转印槽转膜仪、ChemiDocXRS+化学发光成像系统（美国BIO-RAD公司）。

2方法

2.1 药物及试剂的配置PZH在研钵中研成细粉末后，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成20 mg／m L溶液，经高压灭菌后于-20℃贮存备用。RPMI 1640完全基础培养基含10%FBS和1%双抗，4℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养和分组给药HLEC用RPMI 1640完全培养基，置37℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，分成对照组（0 mg／mL）、低剂量组（0.25 mg／mL）、中剂量组（0.5 mg／mL）及高剂量组（0.75 mg／m L）。每组设3个复孔，各组给予相应剂量的PZH干预24 h。

2.3 HLEC生长状态观察取对数生长的HLEC接种于6孔板，经不同浓度PZH干预后，用倒置显微镜观察细胞的生长情况。

2.4 细胞周期检测采用碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况，按细胞周期检测试剂盒说明操作。

2.5 细胞凋亡检测采用AnnexinⅤ／PI染色，流式细胞仪检测HLEC凋亡。具体操作参照细胞凋亡检测试剂盒说明。

2.6 细胞迁移分析采用Transwell实验观察PZH对HLEC迁移能力的影响，实验操作参考Shen等［6］报道的方法，结果采用倒置显微镜观察并成像处理。

2.7 管腔形成分析采用Tube Formation实验观察PZH对HLEC管腔形成的影响，实验操作参考Shen等［7］报道的方法，结果采用倒置显微镜观察并成像处理。

2.8 蛋白表达检测采用Western Blot法检测PZH对HLEC胞浆中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10等蛋白表达的影响，并用凝胶成像系统进行图像数据分析。

2.9 统计学处理多组实验数据间比较使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，数据以x±s表示。

3结果

3.1 PZH对HLEC生长的影响与对照组比较，PZH低、中剂量组HLEC密度未见明显降低，而PZH高剂量组细胞数量减少，见图1。

3.2 PZH对HLEC增殖的影响与对照组比较，PZH低、中剂量组对细胞周期无影响，而PZH高剂量组显著增加G0／G1期细胞的比例，降低S期细胞的比例，对G2／M期无影响，使细胞周期阻滞于G0／G1期。见图2。

3.3 PZH对HLEC凋亡的影响与对照组比较，低、中剂量组对细胞凋亡无明显影响，而高剂量组细胞凋亡增加。见图3。

3.4 PZH对HLEC迁移能力的影响对照组有较多的细胞穿过小孔膜，而不同浓度PZH干预后穿过小孔的细胞数量逐渐减少，呈剂量依赖作用，说明PZH能显著降低HLEC的迁移能力。见图4。

3.5 PZH对HLEC管腔形成能力的影响对照组有较多的管腔形成，而不同浓度PZH干预后能减少HLEC的管腔形成，呈剂量依赖作用，提示PZH能显著降低HLEC的管腔形成能力。见图5。

3.6 PZH对HLEC的VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3／10蛋白表达的影响见图6。

4讨论

据报道，PZH具有保肝［9］、改善心脑血管功能［10］等作用，临床上对多种恶性肿瘤的临床治疗有着显著的效果。前期体内外实验证实了PZH可诱导大肠癌细胞凋亡、抑制大肠癌细胞增殖、转移、耐药及肿瘤血管新生等，但其抗肿瘤转移的机制仍需进一步阐明。近期研究表明：淋巴管新生是肿瘤发生转移的主要因素和重要机制之一，研究PZH抑制淋巴管新生，可进一步揭示其抗肿瘤转移的作用机制。

淋巴管新生指在某些病理状态下，淋巴内皮细胞受趋化因子作用而迁移至局部组织，然后在内皮生长因子作用下增殖形成新的淋巴管，包括淋巴内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的过程，且该过程相当复杂，涉及许多黏附分子、蛋白溶酶、细胞因子和生长因子等的参与，其中，血管内皮生长因子-C（VEGF-C）是最重要的促淋巴管新生因子之一［11］。当VEGF-C与淋巴内皮细胞上的特异性受体VEGFR-3结合后，可通过选择性地促进淋巴细胞增殖、瘤周及瘤内新淋巴管的形成，使原有淋巴管增生、管径增加，参与淋巴管新生与肿瘤转移；也可通过激活下游多条促淋巴管新生相关通路，上调基质金属蛋白酶家族（MMPs）蛋白的表达水平，从而特异性地促进淋巴管生成，引起肿瘤转移［12］。而基质金属蛋白酶家族（MMPs）在细胞迁移过程中也发挥着重要作用［3］，其中，MMP-1可由HLEC产生，溶解相应的胶原，有利于细胞的迁移；MMP-3和MMP-10属于基质溶解酶，能作用于PG（蛋白聚糖）、LN（层粘连蛋白）、FN（纤连蛋白）、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶，促进细胞迁移［13］。因此，VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1、MMP-3／10的表达与肿瘤淋巴管新生、肿瘤转移都密切相关，下调这些蛋白的表达可显著抑制肿瘤淋巴管新生与转移。

本研究以人淋巴内皮细胞（HLEC）为研究对象，用PZH对其进行干预，观察PZH对淋巴管新生的影响。结果显示：PZH低、中剂量组对HLEC的细胞形态、细胞周期、细胞凋亡无明显影响，而PZH高剂量组具有降低细胞密度、增加G0／G1期细胞比例和降低S期细胞比例、诱导HLEC凋亡的显著作用，提示高剂量PZH对抑制HLEC增殖、促进HLEC凋亡具有一定作用。PZH各剂量均可显著降低HLEC的迁移和管腔形成能力，该结果提示PZH抑制淋巴管新生并不是主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，而是通过抑制HLEC的迁移和淋巴管形成能力。此外，PZH能显著下调HLEC中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-1和MMP-3／10的蛋白表达，提示通过下调上述蛋白的表达是PZH抑制淋巴新生的重要作用机制。

然而，作为中药复方的PZH，其化学成分极为复杂，治疗机制具有多途径、多靶点的特点，而淋巴管新生和大肠癌淋巴结转移也是一个复杂的过程，因此后续可进一步通过多条促淋巴管新生信号通路，更系统地探讨PZH抑制大肠癌淋巴结转移的作用机制。

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R285.6

A

1000-338X（2016）04-0043-03

2016-06-05

福建省自然科学基金（2015J01337）

冯健愉（1989—），女，硕士研究生，主要从事中药抗肿瘤的机制研究。

林久茂（1975—），男，副研究员，医学博士，硕士生导师。E－mail：jiumaolin@hotmail.com