神经节苷脂对脂多糖损伤大鼠嗜铬细胞瘤细胞的保护作用*

宋 英， 许西西， 丁 维， 茅东升

(浙江工业大学药学院， 杭州 310014)



神经节苷脂对脂多糖损伤大鼠嗜铬细胞瘤细胞的保护作用*

宋 英△， 许西西， 丁 维， 茅东升

(浙江工业大学药学院， 杭州 310014)

目的：研究内源性神经节苷脂对大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)脂多糖(LPS)损伤后的作用及机制。方法：培养PC12细胞，建立LPS损伤模型，采用MTT法检测不同浓度LPS对PC12细胞存活率的改变、葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂D(D-PDMP)耗竭内源性神经节苷脂时LPS对PC12细胞存活率的改变以及添加外源性神经节苷脂GM1后对PC12细胞存活率的保护作用；倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞状态；RT-PCR检测NF-κB的相对表达含量。结果：LPS能导致PC12细胞形态学的改变及存活率下降，且随着LPS浓度的增加细胞存活率逐渐降低；神经节苷脂GM1能明显改善LPS所致的细胞形态学以及存活率的改变；工具药D-PDMP耗竭内源性神经节苷脂后，LPS对PC12细胞的损伤更严重，添加外源性神经节苷脂GM1，细胞形态学及存活率得到明显改善，细胞存活率上升；LPS损伤时细胞内NF-κB含量增加；D-PDMP预先耗竭内源性神经节苷脂时NF-κB含量增加更多；添加外源性神经节苷脂GM1后NF-κB含量降低。结论：内源性神经节苷脂对PC12细胞LPS损伤具有保护作用, 可能是通过NF-κB信号通路来发挥作用的。

神经节苷脂GM1；大鼠嗜铬细胞瘤细胞株；脂多糖；NF-κB

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.006

神经节苷脂GM1，即单唾液酸四己糖神经节苷脂，是最重要的神经节苷脂之一，广泛存在于脊椎动物组织中，在生物质膜及中枢神经系统中尤为丰富。研究表明，神经节苷脂GM1在一些信号复合体系统中起到至关重要的作用，其中较典型的是其位于膜筏时，能与含有糖脂结合域的特殊蛋白相互作用。

这也就是说，神经节苷脂GM1可能与调控离子转运、神经元分化、G蛋白偶联受体、免疫系统反应、神经信号等机制的蛋白相互作用[1-3]。虽然目前在临床上已经开始使用外源性神经节苷脂GM1来治疗神经退行性疾病，但有关内源性神经节苷脂对神经细胞凋亡的保护作用却鲜有报道。近年来一些研究提示，葡萄糖神经酰胺合成抑制剂D(D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol，D-PDMP)能竞争性抑制葡糖苷酰鞘氨的合成从而耗竭内源性神经节苷脂，进而为内源性神经节苷脂的研究开辟了新领域。我们在之前的研究中发现，神经节苷脂GM1能通过调控PKC信号通路从而对神经细胞损伤后的凋亡起保护作用，但其对于脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎症损伤所致的细胞凋亡是否具有保护作用，仍不可知[4]。本实验中，首先采用D-PDMP耗竭PC12细胞的内源性神经节苷脂，然后通过LPS损伤细胞，进而研究内源性神经节苷脂在细胞损伤过程中发挥的作用，并阐明作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

D-PDMP、神经节苷脂GM1、LPS、碘化丙啶(propidiumiodide，PI)和Hoechst 33342(Sigma公司，美国)；二苯基四氮唑溴盐(MTT)(上海生物技术有限公司)；高糖培养基(DMEM)和马血清(Gibco，美国)；胎牛血清(杭州四季青)；大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)(上海中科院细胞所)。

1.2 D-PDMP细胞毒性考察

将PC12细胞接种于96孔板内。设定正常对照组、D-PDMP处理组(D-PDMP浓度为0.005～50 nmol/l)，培养6 d后采用MTT法测定各组的吸光度值。以正常组细胞存活率为100%，观察D-PDMP的细胞毒性。

1.3 PC12细胞LPS损伤模型的建立

将PC12细胞接种于96孔板内。设立正常对照组、LPS损伤组(LPS浓度为0.1～1 000 nmol/L)，培养24 h后采用MTT法测定各组的吸光度值。以正常组细胞存活率为100%，确定LPS最佳损伤浓度。

1.4 内源性神经节苷脂对PC12细胞损伤的保护作用

将PC12细胞接种，待细胞贴壁后，设立正常对照组、LPS损伤组、D-PDMP+LPS损伤组和GM1干预治疗组。正常对照组：常规培养，作为对照；LPS损伤组：不加D-PDMP，培养6 d，第7天加入LPS；D-PDMP+LPS损伤组：加入D-PDMP，培养6 d，第7天加入LPS；GM1干预治疗组：加入D-PDMP，培养6 d，第7天加入LPS的同时加入不同浓度的神经节苷脂GM1(0.001～10 μmol/L)。24 h后测定各组MTT吸光度值。确定神经节苷脂GM1最佳治疗浓度。

1.5 形态学观察PC12细胞的形态

将PC12细胞接种于6孔板中，同1.4设立正常对照组、LPS损伤组、D-PDMP+LPS损伤组和GM1干预治疗组(此处神经节苷脂GM1浓度选实验得出最佳神经节苷脂GM1浓度)。24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。

1.6 荧光双重染色观察

将PC12细胞接种于6孔板中，实验分组同上。细胞培养24 h后加入终浓度为10 μg/ml的Hoechst 33342和PI进行双重染色，然后在荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死的情况，以明确PC12细胞损伤后的细胞形态学改变。

1.7 RT-PCR检测NF-κB相对表达含量

将PC12细胞接种于6孔板中，实验分组同上。培养24 h后分别提取各组RNA，采用RT-PCR技术测定各组NF-κB含量(F:CTTCTGGGCCATATGTGGAGAT;R: TCGCACTTGTAACGGAAACG)，内参为GAPDH(F:GGTGGACCTCATGGCCTACAT;R: GCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATCCT)。其中引物序列采用Primer Express 2.0和Beacondesigner荧光引物设计软件进行设计，由上海生物工程有限公司负责合成。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 D-PDMP对细胞的毒性作用

用MTT法检测经D-PDMP处理6 d后的PC12细胞的存活率，以正常组细胞存活率为100%，与正常组相比，各组随着内源性神经节苷脂被D-PDMP耗竭细胞存活率没有明显的变化(存活率分别为(99.0±7.4)%、(97.0±7.2)%、(94.9±5.1)%、(95.2±6.4)%、(93.3±4.1)%。

D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

2.2 LPS损伤PC12细胞模型的建立

随着LPS浓度的升高，PC12细胞的存活率逐渐降低，当LPS的浓度为0.1 nmol/L时，细胞存活率可达(76.2±5.7)%。当LPS的浓度为1 000 nmol/L时，细胞存活率仅有(50.0±4.2)%，差异有显著性(P<0.01)。参考文献及预实验, 我们选择100 nmol/L作为损伤模型。

Con: Control; LPS： Lipopolysaccharide

**P<0.01vscontrol group

2.3 内源性神经节苷脂对PC12细胞损伤的保护作用

以正常组细胞存活率为100%，与正常组相比，LPS损伤组存活率为(77.0%±5.4%)和D-PDMP+LPS损伤组存活率为(72.0%±4.2%)细胞均有一定程度的损伤，且D-PDMP+LPS损伤组细胞损伤更严重(P<0.01)，当加入外源性神经节苷脂GM1后，损伤情况均有所改善(P<0.01)当神经节苷脂GM1浓度由0.001 μmol/L增加至0.1 μmol/L时，细胞存活率逐渐增高(存活率分别为83.9%±5.1%、88.3%±3.4%、92.2%±4.1%)；当神经节苷脂GM1浓度高于0.1 μmol/L时，细胞存活率反而下降(存活率分别为87.5%±5.1%、85.6%±3.7%)。即神经节苷脂GM1浓度为0.1 μmol/L时，细胞存活率最高，参考文献以及预实验, 选择0.1 μmol/l作为GM1最佳保护浓度。

Con: Control; LPS: Lipopolysaccharide; D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsD-PDMP+LPS

2.4 倒置显微镜下观察PC12细胞的形态

使用倒置显微镜对各组细胞形态进行观察，正常对照组：(1)PC12细胞胞体轮廓清晰，呈现簇状，有生长突起；LPS损伤组；(2)细胞扁平、皱缩、突起折断或消失；D-PDMP+LPS损伤组；(3)细胞的损伤比LPS损伤组更为严重，细胞明显皱缩，突起基本全部消失；GM1干预治疗组；(4)损伤明显有所减轻，细胞形态呈梭形或不规则，可见突起生长(图4，图4见彩图页Ⅺ)。

2.5 荧光双重染色观察细胞凋亡、坏死情况

荧光显微镜下观察各组细胞的凋亡情况，正常的PC12细胞核呈均匀蓝色，凋亡细胞表现为核凝聚、深染，呈深蓝色，坏死细胞着色为粉红色。正常对照组细胞生长状况好，几乎未发生死亡；LPS损伤组细胞状态不佳，出现细胞死亡现象；D-PDMP+LPS损伤组细胞凋亡、坏死现象均增多；而GM1干预治疗组细胞状态得到改善，细胞凋亡、坏死现象均有所减轻(图5，图5见彩图页Ⅺ)。

2.6 RT-PCR检测NF-κB相对表达含量

采用SYBRGreenRT-PCR法进行检测，根据公式2-△△Ct，进行数据统计。与正常组相比，损伤组细胞中的NF-κB的表达明显增高，且D-PDMP+LPS损伤组高于LPS损伤组(P<0.05)，这说明可能是由于D-PDMP的抑制作用使LPS对PC12细胞的损伤加剧，所以D-PDMP+LPS损伤组NF-κB的表达多于LPS损伤组；而对于GM1干预治疗组，NF-κB的表达则明显低于损伤组(P<0.05)，这表明内源性神经节苷脂可能通过抑制NF-κB信号通路的活化，来实现细胞保护作用的(表1)。

3 讨论

内源性神经节苷脂与神经系统发育及脑组织保护之间关系十分复杂。近年来，关于神经节苷脂GM1及其相关蛋白质的研究已经越来越引起人们的重视。众多研究表明，神经节苷脂GM1能影响中枢及外周神经系统的发育、参与神经细胞轴突的生长与再生以及保护脑缺血所造成的脑损伤作用[5-7]，也可能与神经退行性疾病的发病机制相关[8-11]。但是由于内源性神经节苷脂的研究缺乏工具药，其作用及作用机制仍有待被阐明。

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其有可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。本实验中选取PC12细胞建立LPS损伤模型，来证明内源性神经节苷脂对细胞LPS损伤的保护作用。实验数据显示，长时间以D-PDMP处理PC12细胞并不引起细胞存活率的改变，这说明D-PDMP本身不具有细胞毒性，耗竭内源性神经节苷脂并不造成细胞生长障碍，而使用D-PDMP竞争性抑制内源性神经节苷脂后，会加重LPS诱导的细胞损伤，这间接表明内源性神经节苷脂在LPS损伤时，具有一定的细胞保护作用。添加外源性神经节苷脂GM1对LPS的损伤具有保护作用，当D-PDMP耗竭内源性神经节苷脂时神经节苷脂GM1可以逆转由于内源性神经节苷脂不足而导致的细胞损伤加重。实验中发现NF-κB含量与各组细胞损伤程度呈正相关关系。由于NF-κB是介导很多免疫及炎症反应的中心物质，同时也是细胞凋亡信号通路中重要的转录调节因子。因此，我们猜想内源性神经节苷脂对PC12细胞LPS损伤的保护作用可能是通过调控NF-κB信号通路的活化来发挥作用的。

Tab. 1 Apoptosis and necrosis cells and relative expression of ±s， n=3)

LPS: Lipopolysaccharide; D-PDMP: D-threo-1-1-phenyl-2-decanoylamin-3-morpholino-propanol

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsD-PDMP+LPS

本实验证明了内源性神经节苷脂对细胞LPS损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的活化来实现的，这将为内源性神经节苷脂在神经损伤方面的作用研究提供一定的理论依据。

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The protective effects of gangliosides on LPS-induced PC12 cells injury

SONG Ying△, XU Xi-xi, DING Wei, MAO Dong-sheng

(Technology of Zhejiang University, Hangzhou 310014, China)

Objective: To investigate the protective effects of endogenous gangliosides on LPS-induced PC12 cells injury and its possible mechanism. Methods: PC12 cells were cultured, and lipopolysaccharide(LPS) injury model was established. We detected the changes in survival rate of different concentrations of LPS on PC12 cells, and the changes in survival rate of LPS when endogenous gangliosides were exhausted by D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol(D-PDMP), and the protective effects of monosialoganglioside (GM1) on LPS-induced PC12 cells injury. Meanwhile, we observed the morphological changes of GM1 on PC12 cells induced after LPS injury by inverted microscope and fluorescence microscope, and then we detected the relative expression of NF-κB. Results: LPS could decrease the survival rate of cells in a concentration-dependent manner, and GM1 could significantly protect the cells against the changes in survival rate and morphological damages induced by LPS; After depletion of endogenous gangliosides by D-PDMP, LPS had more injury to PC12 cells, which could be improved by adding GM1; RT-PCR results showed that the relative expression of NF-κB in PC12 cells was increased in LPS group, while relative expression of NF-κB increased much higher when endogenous gangliosides were exhausted by D-PDMP, and the relative expression of NF-κB was decreased after GM1 being added. Conclusion: The endogenous gangliosides might through NF-κB signal pathway to protect PC12 cells against LPS-induced injury.

monosialoganglioside(GM1); PC12 cells; LPS; NF-κB

浙江省自然基金(LY13H090006)；全国临床药学研究基金(L2011079)

2015-12-07

2016-02-16

R741

A

1000-6834(2016)04-310-05

△【通讯作者】Tel： 0571-88320535； E-mail： songying@zjut.edu.cn