槟榔碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响*

奉水东， 伍 迪， 杨丝丝， 何剑琴， 张恺芳， 凌宏艳Δ

(1. 南华大学公共卫生学院社会医学与卫生事业管理学教研室， 2. 南华大学医学院生理学教研室， 湖南 衡阳 421001)



槟榔碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响*

奉水东1+， 伍 迪2+， 杨丝丝2， 何剑琴2， 张恺芳2， 凌宏艳2Δ

(1. 南华大学公共卫生学院社会医学与卫生事业管理学教研室， 2. 南华大学医学院生理学教研室， 湖南 衡阳 421001)

目的：观察槟榔碱对人乳腺癌细胞(MCF-7)增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0、10、30、50、100、300、500 μmol/L)槟榔碱对MCF-7细胞增殖的影响，Hoechst 33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测Bax，Bcl-2和P53蛋白表达。结果：低浓度(0、10、30、50 μmol/L)槟榔碱不影响细胞的增殖和凋亡；而高浓度(100、300、500 μmol/L)槟榔碱呈浓度依赖性抑制MCF-7细胞增殖、诱导MCF-7细胞凋亡、提高P53和Bax蛋白表达、降低Bcl-2蛋白表达。结论：高浓度槟榔碱抑制MCF-7细胞增殖、诱导凋亡，其机制可能与提高P53和Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达有关。

槟榔碱；MCF7细胞；增殖；凋亡

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.021

乳腺癌是严重危害妇女健康的主要恶性肿瘤，其发病率逐年上升。当前，对乳腺癌的治疗主要是手术治疗、辅以化疗，但辅助化疗常会出现许多不良反应。因此，寻找高效、特异和低毒的抗肿瘤药物是肿瘤防治研究中的重要课题。天然植物由于来源广泛、类型多样、不良反应小，具有开发为化疗药物增效减毒辅助药物的潜力备受关注。槟榔碱(arecoline)是从天然植物槟榔中提取的生物碱，研究发现槟榔碱具有杀菌、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化、改善2型糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱和肝脏胰岛素抵抗等作用[1-3]；槟榔碱也可通过诱导上皮细胞的凋亡参与口腔黏膜下纤维性变的发生[4]，但槟榔碱是否影响乳腺癌细胞的增殖和凋亡，目前未见相关文献报道。因此，本研究观察不同浓度槟榔碱对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7细胞购于美国ATCC公司，L-DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购于美国Gibco公司，槟榔碱、MTT和Hoechst 33342染料均购于Sigma公司，抗Bax、Bcl-2和P53抗体购于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将第7代人乳腺癌MCF-7细胞接种于6 cm培养皿中，加入含10%胎牛血清的L-DMEM 培养液，在37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%时，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 MCF-7细胞生长的检测 采用MTT法，将MCF-7细胞按每孔5×103个细胞接种于96孔板中，每孔体积100 μl，待细胞长到50%～60% 融合时更换无血清的DMEM同步化24 h后进入实验，然后加入不同浓度的槟榔碱处理，使其终浓度分别为0、10、30、50、100、300、500 μmol/L，每个浓度设3个复孔。处理24 h和48 h后，弃含药物培养液，每孔分别加入新鲜培养液180 μl置于细胞培养箱中平衡30 min，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养。然后将培养液倒尽吸干，每孔加入150 μl DMSO，37℃振荡15 min，在酶标仪上选择570 nm波长，测定各孔的光密度值。按下式计算细胞生长抑制率，生长抑制率=(对照组平均OD-实验组平均OD 值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 采用Hoechst 33342染色法，将MCF-7细胞以5×103/孔的密度接种于24孔板中培养24 h，然后分别加入不同浓度的槟榔碱(0、10、30、50、100、300、500 μmol/L)处理48 h后。弃含药物培养液，加入终浓度为10 μg/ml的Hoechst 33342荧光染料至药物处理后的细胞中，37℃ 孵育20 min，用PBS清洗2次后在荧光显微镜下观察结果。

1.2.4 流式细胞术分析MCF-7细胞凋亡率 不同浓度的槟榔碱(0、10、30、50、100、300、500 μmol /L)处理MCF-7细胞48 h后，收集细胞。按照Annex in-FITC/PI法流式细胞仪分析检测细胞凋亡。将样品1 500 r/min 离心10 min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，用结合缓冲液重新悬浮细胞，调整其浓度为1×106/ml，取195 μl细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀后间隔3 min，再加入10 μl 20 μg/ml PI 溶液，混匀后于室温避光孵育15 min， 加入300 μl结合缓冲液，轻轻混匀，在流式细胞仪进行检测和结果分析。

1.2.5 Western blot检测MCF-7细胞Bax，Bcl-2和P53蛋白的表达 将MCF-7细胞接种于6 cm细胞培养皿中培养24 h，然后分别加入不同浓度的槟榔碱(0、100、300、500 μmol/L)处理48 h后，提取蛋白质并测定蛋白质浓度，取蛋白样品30 μg进行SDS-PAGE电泳, 转膜、封闭、加入抗P53, Bax及Bcl-2抗体孵育，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 槟榔碱对MCF-7细胞生长的作用

给予不同浓度的槟榔碱(10、30、50、100、300、500 μmol/L)处理MCF-7细胞24 h后，生长抑制率结果显示：低浓度(10、30、50 μmol/L)槟榔碱可促进MCF7细胞生长，但与对照组(0 μmol/L)相比无显著性差异；而高浓度(100、300、500 μmol/L)槟榔碱呈浓度依赖性抑制MCF-7细胞生长。当处理时间延长至48 h 时，高浓度的槟榔碱对MCF-7细胞生长的抑制作用愈加明显，且呈剂量依赖效应，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01,表1)。

GroupGrowthinhibitionrate(%)24h48hControl 0 010μmol/L2．7±0．83．2±1．130μmol/L4．4±1．25．7±1．650μmol/L6．3±2．18．9±3．2100μmol/L16．6±3．3∗∗24．6±4．1∗∗300μmol/L30．5±3．9∗∗52．5±4．5∗∗500μmol/L42．8±6．2∗∗70．3±7．2∗∗

**P<0.01vscontrol group

2.2 槟榔碱对MCF-7细胞凋亡的影响

Hoechst 33342染色和流式细胞术凋亡检测结果显示：低浓度(10、30、50 μmol/L)槟榔碱不影响细胞凋亡，高浓度(100、300、500 μmol /L)槟榔碱呈浓度依赖性促进MCF-7细胞凋亡(P<0.05,P<0.01,图1、表2)。Hoechst 33342染色显示：凋亡的细胞表现为细胞核染色质聚集、致密、浓染、荧光增强、细胞核染色质固缩或碎裂成2块以上。随后我们选择(0、100、300、500 μmol /L)槟榔碱浓度进行机制分析。

Fig. 1 Effects of different concentration of arecoline on the nuclear morphology of MCF-7

A，B，C，D，E，F，G is 0，10，30, 50、100、300、500 μmol/L arecoline group

GroupCellapoptosisrate(%)Control2．98±0．3610μmol/L3．27±0．3330μmol/L3．65±0．2950μmol/L4．26±0．35100μmol/L21．53±0．46∗300μmol/L45．21±0．53∗∗500μmol/L53．47±0．69∗∗

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 槟榔碱对MCF-7细胞P53, Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，高浓度(100、300、500 μmol/L)槟榔碱可提高MCF-7细胞P53, Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达 (图2,表3)。

Fig. 2 Effects of arecoline on protein level of P53，Bax and Bcl-2 of MCF7 cells

1: Control group; 2: 100 μmol/L group; 3: 300 μmol/L group; 4: 500 μmol/L group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 讨论

肿瘤无限制增生的恶性生物学特征与肿瘤细胞凋亡减少有关，增加肿瘤细胞凋亡是一种有效治疗手段。中药治疗肿瘤以其低毒性，有一定的疗效而日益引起人们的重视。槟榔碱是从中药槟榔果中提取出的单体生物碱，具有驱虫、促消化、抗氧化、抗动脉粥样硬化等药理作用。也有研究显示槟榔碱可通过诱导DNA 损伤断裂、阻滞细胞周期、调控凋亡基因等作用而诱导细胞凋亡[5]。但槟榔碱是否对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡产生影响，目前尚未见文献报道。为此，本研究通过MTT分析、Hoechst染色和流式细胞术观察这一现象，结果显示：高浓度的槟榔碱可抑制MCF-7增殖，促进凋亡。为进一步探讨槟榔碱的作用机制，我们检测凋亡相关蛋白的表达。

Bcl-2基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因，其中Bcl-2在细胞受到外界刺激时可延长细胞周期、保护细胞免于凋亡，而Bax在细胞凋亡过程中，发挥着重要的枢纽作用[6]。P53基因为抑癌基因，具有促进细胞凋亡的作用[7]。本实验发现槟榔碱可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白P53、Bax的表达，提示槟榔碱可能是通过调控P53、Bax和Bcl-2诱导细胞凋亡，达到抑制MCF-7细胞生长及增殖的作用。

总之，该研究为槟榔碱用于乳腺癌的治疗提供了有用的实验依据，但槟榔碱是否对其他乳腺癌细胞具有类似MCF-7细胞的作用，仍需进一步实验。

[1] 姚起鑫, 亓竹青, 王 光, 等. 槟榔碱改善2型糖尿病大鼠糖、脂代谢紊乱[J]. 中国药理学通报， 2009, 25(11): 1477-1481.

[2] 亓竹青, 姚起鑫, 王 光, 等. 槟榔碱对2型糖尿病大鼠胰腺细胞PDX-1 mRNA表达的影响[J]. 国际病理科学与临床杂志， 2010, 30(1): 14-19.

[3] 凌宏艳， 姚起鑫， 亓竹青, 等. 槟榔碱对2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用[J]. 中国应用生理学杂志， 2014， 30(3)： 254-258.

[4] Li M, Gao F, Zhou ZS,etal. Arecoline inhibits epithelial cell viability by upregulating the apoptosis pathway: implication for oral submucous fibrosis[J].OncolRep， 2014， 31(5): 2422-2428.

[5] Tseng SK, Chang MC, Su CY,etal. Arecoline induced cell cycle arrest, apoptosis, and cytotoxicity to human endothelial cells[J].ClinOralInvestig， 2012, 16(4): 1267-1273.

[6] Rengarajan T, Nandakumar N, Rajendran P,etal. D-pinitol promotes apoptosis in MCF-7 cellsviainduction of p53 and Bax and inhibition of Bcl-2 and NF-κB[J].AsianPacJCancerPrev， 2014， 15(4): 1757-1762.

[7] Pirouzpanah MB, Sabzichi M, Pirouzpanah S,etal. Silibilin-induces apoptosis in breast cancer cells by modulating p53, p21, Bak and Bcl-xl pathways[J].AsianPacJCancerPrev， 2015, 16(5): 2087-2092.

Effect of arecoline on proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells

FENG Shui-dong1+, WU Di2+, YANG Si-si2, HE Jian-qin2, ZHANG Kai-fang2, LING Hong-yan2Δ

(1. Department of Social Medicine and Health Service Management, School of Public Health, 2. Department of Physiology,School of Medicine, University of South China, Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of arecoline on proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells and to explore its possible mechanism. Methods：Human breast cancer MCF-7 cells were treated with arecoline at the concentrations of 0,10,30,50,100,300,500 μmol/L, the cell proliferation were detected by MTT assay, cell apoptosis were analyzed by Hoechst 33342 staining and flow cytometry, the protein expression of Bax,Bcl-2 and P53 were detected by Western blot. Results： Low concentration(0，10，30, 50 μmol/L)arecoline had no effect on the proliferation and apoptosis of MCF-7. However, high concentration(100,300,500 μmol/L)arecoline inhibited proliferation and induced apoptosis of MCF-7 cells in a concentration-dependent manner, arecoline also significantly increased P53 and Bax protein expression and decreased Bcl-2 protein expression. Conclusion: High concentration arecoline inhibited the proliferation and induced the apoptosis of MCF-7 cells， the mechanism was probably corrected with increasing P53 and Bax protein expression and decreasing Bcl-2 protein expression.

arecoline; MCF-7 cells; proliferation; apoptosis

教育部留学归国基金(教外司留[2014]1685号)；中国博士后科学基金(2012M511384)；湖南省科技厅(2015JC3085)项目资助；南华大学留学归国基金项目(2013XQD49)

2015-06-08

2016-02-29

R781.5

A

1000-6834(2016)04-370-03

△【通讯作者】Tel: 86-0734-8281389; E-mail: linghongyan0203@126.com.+： 共同第一作者