应用PCR-DGGE技术分析福州左海湖的细菌群落组成

吕 新，刘兰英，陈丽华，李玥仁*，林碧娇

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 3500032.精密仪器农业测试重点公共实验室，福建 福州 350003)



应用PCR-DGGE技术分析福州左海湖的细菌群落组成

吕 新1，2，刘兰英1，2，陈丽华1，2，李玥仁1，2*，林碧娇1，2

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 3500032.精密仪器农业测试重点公共实验室，福建 福州 350003)

应用PCR-DGGE技术对4个月份(2011年12月、2012年2月、4月、6月)的福州左海湖细菌群落组成和优势菌群进行分析，研究结果发现相同月份4个采样点的DGGE图谱差异性不大，细菌群落组成具有较高的相似性；而不同月份4个采样点的DGGE条带的数目和位置表现出明显差异，细菌群落组成差异明显。对20条不同位置的DGGE条带进行切胶回收、扩增和测序后，进行系统进化分析，结果显示这20条带归属于4个细菌类群，即变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria。20条序列中有11条鉴定为变形细菌门Proteobacteria、5条鉴定为拟杆菌门Bacteroidetes、2条鉴定为放线菌门Actinobacteria、其余2条属于蓝细菌门Cyanobacteria。研究结果表明，左海湖细菌群落组成包括了Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria，其中以Proteobacteria为优势菌群。

左海湖；细菌群落组成；16S rRNA；PCR-DGGE

福州左海公园是福州市区面积最大的公园，位于福州的西北部，东与西湖公园相邻，西依二环路，北临铜盘路，南靠象山。全园面积33.77 hm2，其中湖面面积18.14 hm2，是福州市民主要休闲和娱乐场所之一。2008年6月初，左海公园湖水中出现了外表半透明果胶状，形似水母被称为“左海水怪”的不明生物体。“水怪”的出现可能与水生生态系统中环境因子的改变有关，而在水生生态系统中，微生物是最为敏感并极易受环境影响因子的生物类群。他们不仅是水生生态系统中生物量的重要组成部分，而且影响物质循环和营养传递的过程。细菌作为水体微生物的主要类群，是水体中复杂有机物和矿质元素转化的最重要的贡献者[1]，因此对水体中细菌群落结构的研究，是弄清微生物作用过程的先决条件。然而，利用分离培养的方法，仅能获取环境中不到1%的细菌类群[2]。大量的细菌类群在分离培养过程中被遗失，容易造成对左海湖水体细菌类群状况认识的失真[3]。PCR-DGGE等现代分子生物学方法不但摆脱了对传统培养条件的依赖，而且可以对生态群落的结构变化进行快速有效地分析，大大提高了人类对实际环境中微生物多样性认识的全面性。

近年来越来越多的研究人员利用该技术，系统研究水生生态系统中细菌群落结构组成与动态变化[4]。迄今为止，有关福州左海湖细菌群落组成及优势菌群方面的研究尚属空白。本研究利用PCR-DGGE分子生物学方法对福州左海湖的细菌群落组成及优势菌群进行了分析研究，获得了左海湖的细菌群落指纹图谱及群落组成，这将为左海湖的水体环境保护和综合治理提供理论依据和参考数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

根据左海湖湖区分布特点，设置4个不同采样位点，具体采样位置见图1，分别于2011年12月、2012年2月、4月、6月取样分析。使用经酸浸泡、清洗干净的矿泉水瓶，采集上述4个采样点水深20 cm左右处水样800 mL，每点重复取样3次。放入带有冰块的保温箱中运回实验室，用于基因组DNA的提取分析。

1.2 水体中细菌的收集

取500 mL水样用定性滤纸(8 μm，55 mm，Whatman)过滤，去除颗粒杂质以及真核生物, 滤液再通过聚碳酸酯膜(0.2 μm，47 mm，Whatman)真空抽滤，然后用无菌水冲洗两次．将滤膜取出剪成碎片，装入1.5 mL的离心管中，-70℃保存备用。

1.3 样品总DNA的提取

将离心管室温下解冻，加入400 μL 1×TE(pH 8.0)和30 μL 50 mg·mL-1溶菌酶溶液，37℃温育30 min后，加入40 μL 10% SDS溶液和l0 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，37℃接着温育30 min。随后加入70 μL 5 mol·L-1NaCl和56 μL CTAB/NaCl，上下颠倒混匀后，在55℃温育15 min。吸取上清液置1.5 mL离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡混匀。在室温下12 000 r·min-1离心7 min，取上清液置1.5 mL离心管中，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀，室温下12 000 r·min-1离心5 min。取上清液置于新离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，置-20℃冰箱中放置过夜，室温下12 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用70 %的酒精洗涤沉淀2次，将离心管倒置于吸水纸上晾干。加入50 μL 1×TE(pH 8.0)溶解DNA(TE中含5 μg·μL-1RNaseA)，37℃保温1 h后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，并稀释至50 ng·μL-1备用。

1.4 PCR-DGGE分析

使用16S rRNA V3区通用引物338f (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC-3′)和530R (5′-GTA TTA CCG CGG CTG CTG-3′)从水样基因组总DNA中扩增16S rRNA V3区基因片段，为使扩增产物能在DGGE上分离得更好，在引物338f 5'端引入一个39 bp的GC发卡结构(5′-CGC CCG CCG CGC CCC CGC CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC-3′)。PCR反应体系总体积50 μL，各反应组分终浓度为：5.0 μL 10×buffer(Mg2+free)，1.5 mmol·L-1MgC12，0.2 mmol·L-1dNTP，0.8 μmol·L-1上下游引物，50 ng 模板DNA，2.0 U Ex-Taq酶(Takara公司)，不足部分由无菌超纯水补足。在PTC-200型PCR仪上(Bio-Rad公司)按以下循环条件扩增：95℃，2 min；95℃，1 min，60℃，1 min，72℃，90 s，35个循环；72℃，30 min。反应结束后，取3.0 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上，5 V·cm-1电压电泳30 min后分析拍照，其余置4℃保存备用。

对上述PCR扩增产物在 INGENY phorU-2 system(Ingeny International BV))上进行DGGE分离来研究左海水域微生物群落多样性。聚丙烯酰胺的变性梯度范围为35%～60%，凝胶浓度10%，DNA扩增产物上样量约为10～15 μL(200 ng)，1×TAE缓冲液中90 V电压下电泳14 h。电泳完毕后用Invitrogen SYBR Gold染料(1×TAE，1∶10 000)染色30 min，使用Kodak Gel Logic 2200成像系统来成像分析。

1.5 细菌16S rRNA V3区片段的回收及克隆

从DGGE凝胶上小心切下DGGE条带，装入1.5 mL的离心管中。使用聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒(上海生工)纯化，以纯化产物为模板重新扩增，扩增方法同1.4所述。扩增产物经DGGE确认为单一条带后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)纯化，连接到PMD-18T载体(Takara公司)，转化E.coliJM109感受态细胞，在含有x-gal(20 μg·mL-1)、IPTG(24 μg·mL-1)和氨苄青霉素(50 μg·mL-1)的LB培养基上挑取白色的菌落。采用通用M13上下游引物进行菌落PCR，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为阳性克隆后，送上海生工生物公司进行测序。

1.6 细菌DGGE图谱及群落相似性分析

使用Quantity one软件(Bio-Rad, USA)对DGGE电泳图片进行分析，比较各时期样品的细菌DGGE条带数目和相对灰度值；采用非加权配对算数平均法(Unweighted pair group method with arithmetic averages，UPGMA)对不同月份各点样品之间进行聚类分析，研究不同月份各采样点间细菌群落的相似性关系。

1.7 系统发育分析

测序获得的16S rRNA 序列与BLAST 比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得与每条序列相似性最高的序列。使用CLUSTALX 1.81工具进行多序列排列比对，应用MEGA 4.0[5]软件的邻位相接法建立系统进化树，进化树的支持率是进行1 000次重复运算得到的结果。

2 结果与分析

2.1 左海湖细菌群落DGGE图谱分析

4个月份各采样点DGGE图谱如图2所示，条带的多少反映细菌群落的多样性，条带的明暗反映细菌群落相对数量高低，从而确定各采样点细菌群落种类和数量关系，得出细菌群落多样性信息。从图2中可以看出，4个月份各采样点获得了18～26条不同位置的DGGE条带，相同月份各采样点的DGGE条带数量、位置比较相似，而不同月份各采样点的DGGE条带数量、位置则存在明显差异。4个月份各采样点有相同条带出现(Band-3、Band-8、Band-10、Band-11、Band-14、Band-19)，说明左海湖水体中存在共有的细菌类群，尤其是Band-10在4个月份亮度均较高，可能为水体中的优势类群。而非共有条带仅出现在个别月份，如Band-1和Band-16仅在12月份和2月份采样点出现过，说明这些条带是12月份和2月份水体样品中特有的细菌类群。

进一步通过UPGMA聚类方法对4个月份各采样点DGGE图谱相似性进行分析(图3)，结果发现4个月份的采样点中，相同月份的4个采样点往往聚在一起，说明相同月份采样点的细菌群落结构组成相似性较高。其中以采样点A和B的细菌群落结构组成最为相似，4个月份中有3个月份聚类分析时紧邻在一起，且细菌群落结构组成相似性在85%以上；而采样点D相比其他3个采样点，其细菌群落结构组成与其他3个采样点存在一定差异，这在聚类分析时表现为其距离其他3个采样点较远。

2.2 16S rRNA序列及系统发育分析

细菌16S rRNA V3区片段经DGGE分离、切胶回收，共得到20个DGGE条带，编号：B1-B20 (图2)，将条带进行克隆测序，所得序列大小在174～199 bp范围内，序列结果在GenBank 数据库中进行BLAST 比对。结果显示，所有序列与数据库中的16S rRNA序列的相似性在95%～100%，20条相似性序列大多数来自于淡水水体环境[6-7]，其中有18条与之最相似的16S rRNA序列均属于不可培养的细菌类型。获得的20条相似性序列与数据库中的参考序列一起构建系统进化树(图4)，结果表明20条序列分别归属于4个细菌类群：变形细菌门Proteobacteria包括α-、β-和γ-Proteobacteria 3个亚群、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria。在20条序列中有11条分别与变形细菌门中α-Proteobacteria(3条)，β-Proteobacteria(7条)和γ-Proteobacteria(1条)相似，5条与拟杆菌门Bacteroidetes相似，2条与放线菌门Actinobacteria相似，2条与蓝细菌门Cyanobacteria相似。

2.3 左海湖细菌群落的组成及优势菌群分析

通过Quantity one软件(Bio-Rad, USA)获得不同月份左海湖细菌群落DGGE图谱中不同条带峰面积值(Trace Qty)，来分析左海湖水体中细菌群落组成和优势菌群(图5)。从图5可以看出，左海湖水体中细菌群落组成包括了4个细菌类群：Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria，4个细菌类群在不同月份各采样点均有不同程度分布。Proteobacteria在2011年12月、2012年2月、4月、6月所占比例分别为54.9%、54.9%、47.0%、59.2%；Bacteroidetes在4个月份所占比例分别为19.7%、20.6%、19.1%、17.7%；Actinobacteria在4个月份所占比例分别为9.0%、14.7 %、12.5%、14.2%；Cyanobacteria在4个月份所占比例分别为16.6%、9.8%、21.4%、9.2%，Proteobacteria在4个月份采样点中所占比例均最多，为左海湖水优势的细菌类群。

本研究中，Proteobacteria中β-Proteobacteria所占比例远高于α-和γ-Proteobacteria 2类细菌类群，在4个月份的各采样点中所占比例均为最多(图6)，分布最多的为2012年6月的D采样点(42.9%)，最少的为2012年4月的C采样点(25.1%)。α-Proteobacteria所占比例仅次于β-Proteobacteria(图6)，分布在4个月份的各采样点中，分布最多的为2012年2月的D采样点(25.2%)，最少的为2012年4月的C采样点(14.3%)。γ-Proteobacteria与α-和β-Proteobacteria相比(图6)，在左海细菌群落组成中属于特殊的类群，在4个月份中所占的比例最少，甚至在2012年4月各采样点均没有检测到，而在2月和6月仅分布在这2个时期的第4个采样点中，分别占3.3%和8.8%，在该采样点细菌类群中所占的比例也最少。

Cyanobacteria在4个月份的细菌群落组成中所占比例变化较大(图6)，2011年12月(16.6%)和2012年4月(21.4%)所占比例明显高于2012年2月(9.8%)和6月(9.2%)。

3 讨论与结论

本研究采用PCR-DGGE分子生物学技术首次对福州左海湖水体细菌群落组成及其优势菌群进行研究。虽然DGGE技术在分析微生物群落结构组成时有一定的缺陷[8]，但该技术仍然是目前微生物群落多样性研究中普遍采用的方法之一。

有研究表明尽管不同湖泊物理化学特性各异, 但其水体中主要细菌类群一般只有少数的几种, 其中最主要的为革兰氏阴性的Proteobacteria (包括α、 β、 γ、δ和ε亚群)和阳性的Bacteroidetes[9-10]。本研究表明，左海湖水中的优势细菌类群为Proteobacteria，其次为Bacteroidetes，这与淡水生态系统典型类群一致[1，6]。其中β-Proteobacteria在左海湖水总细菌中的比例最高，γ-Proteobacteria所占比例最低，而δ和ε在本研究中并没有检测到，有研究者推测δ和ε的数量减少或消失可指示水体的污染程度[11]。Lindstrom等[12]研究指出与酸性水质相比，α-Proteobacteria 在中性和碱性介质中的分布更丰富。本研究结果也发现随着水体pH的降低，α-Proteobacteria的比例也逐渐减少，例如，α-Proteobacteria在12月份左海水体中的比例是最高的，其水质pH为7.95(未发表数据)，而到6月份时，水质的pH降为7.15，此时α-Proteobacteria在该月所占的比例是最低的。这表明，水质pH的波动对细菌群落组成可能会有直接的影响。有研究表明γ-Proteobacteria多为可培养细菌，主要分布在湖底沉积物、海洋和超盐等环境中[13-17]，本研究发现γ-Proteobacteria在左海湖水体中仅有少量分布，这与相关的研究结论一致。

有研究指出[11-18]，Bacteroidetes和Firmicutes可能和水体极度富营养化密切相关，并且仍占数量优势的β-Proteobacteria在营养趋富情况下种属水平上的变化也可能是对富营养化的一种响应。我们研究发现，左海湖水中的数量比例较高细菌类群正是β-Proteobacteria和Bacteroidetes，说明左海湖水体可能已经出现了富营养化的情况。

Lan Wu等[19]研究表明Actinobacteria在淡水生态系统中也是普遍存在的菌群之一。在本研究中Actinobacteria克隆到的序列虽然仅占总序列的10%，但是它在4个月份所占的比例也不算很低，分别为9.0%、14.7%、12.5% 和14.2%，进一步说明Actinobacteria也是淡水生态系统中常见的浮游细菌。

有研究表明Cyanobacteria群落多样性与环境温度呈显著性相关[7，20]。在本研究中发现冬季(2012年2月)环境温度低不利于Cyanobacteria生长，其所占比例较少。而适宜的环境温度Cyanobacteria则生长活跃，所占比例明显增加(2011年12月、2012年4月)，但过高的环境温度可能又会抑制Cyanobacteria生长(2012年6月)，所占比例减少。

系统进化分析表明，在克隆到的20条DGGE条带中，只有3条(Band-1、Band-6、Band-9)与GenBank中已有的细菌同源性低于100%，这说明左海湖水大多数细菌序列与GenBank 数据库中收录的细菌序列具有高度的相似性。

综上所述，本研究首次采用PCR-DGGE技术对福州左海湖水体的细菌群落结构组成进行探讨，获得左海湖水细菌群落组成和优势菌群情况。研究结果表明，左海湖水细菌群落由4个细菌类群组成：变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria。其中Proteobacteria为优势菌群，但在不同采样时期，这些细菌类群所占的比例是不一样的。本研究只是初步分析了左海湖水体中细菌群落组成和优势菌群情况，对于细菌群落组成在不同季节和不同年份的动态变化情况尚有待进一步研究，以期获得长期的变化数据，从而为左海水环境的保护和治理提供必要的科学依据。

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(责任编辑：柯文辉)

Composition of Bacterial Community at Lake Zuohai Determined by PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

LÜ Xin1，2，LIU Lan-ying1，2，CHEN Li-hua1，2，LI Yue-ren1，2*，LIN Bi-jiao1，2

(1.InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyResearch,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China;2.KeyLaboratoryforPrecisionInstrumentTestsinAgriculturalFields,Fuzhou,Fujian350003,China)

Composition and predominant groups of the bacterial community in Lake Zouhai in the city of Fuzhou were determined and analyzed by using PCR-DGGE. Water samples were collected from 4 sites each time in December 2011, February 2012, April 2012, and June 2012. The results showed that the water samples from the different sites on a same date had a similar bacterial composition, while the numbers and positions of DGGE profiles indicated significant compositional differences on different dates. Twenty DGGE bands with varied phylotypes were excised, cloned, sequenced, and analyzed to show 11 of them having possible affiliations with Proteobacteria, 5 with Bacteroidetes, two with Actinobacteria, and two with Cyanobacteria. Analysis on the bacterial compositions suggested that Proteobacteria was the predominant group existed in the lake.

lake Zuohai; bacterial community composition; 16S rRNA; PCR-DGGE of sampling sites

2016-03-08初稿；2016-06-11修改稿

吕新(1980-)，男，硕士，助理研究员，主要从事微生物生态学研究(E-mail: lux_ing@126.com)

并列第一作者：刘兰英(1987-)，女，研究实习员，主要从事微生物生态学研究(E-mail: lly87119@126.com)

福建省自然科学基金项目(2011J01118)；福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1025-1)；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目(2016P1-18)；福建省农业科学院青年人才创新基金(2014QB-31)

Q 938.8；X 172

A

1008-0384(2016)09-986-07

吕新，刘兰英，陈丽华，等.应用PCR-DGGE技术分析福州左海湖的细菌群落组成[J].福建农业学报，2016，31(9)：986-992.

LÜ X，LIU L-Y，CHEN L-H，et al.Composition of Bacterial Community at Lake Zuohai Determined by PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：986-992.

*通讯作者：李玥仁(1966-)，男，博士，研究员，主要从事微生物生态学研究(E-mail: yuerenli@yeah.net)