环介导等温扩增（LAMP）技术及其在鸭病病原检测中的应用研究进展

于新友 李天芝 苗立中

摘 要：环介导等温扩增（LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便和成本低等特点，越来越受到兽医相关工作者的关注。目前，该方法己被广泛应用各种动物病原的检测。本文综述了LAMP 技术在鸭传染病病原检测中的应用研究进展情况，以期为今后鸭病的诊断和防控工作提供参考。

关键词：LAMP；鸭病；病原；检测；应用

中图分类号：S818.9 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2016）04-0043-06

鸭传染病对养鸭业的威胁时刻存在，目前养殖场主要是将病料送专业检测实验室进行病原分离鉴定或PCR检测，一旦出现疫情，由于条件所限，很难实现对疫病的快速检测。日本学者Notomi 等[1]开发了一种新型核酸扩增技术，即环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，该技术不需要模板的热变性[2]、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，整个反应在恒温条件下进行，反应结束后，结果可用肉眼直接观察[3]，在疫病诊断领域显示了广阔的应用前景，本文就LAMP技术及其在鸭病病原检测中的应用研究进展综述如下。

1 LAMP技术

1.1 LAMP扩增原理 LAMP技术是针对靶基因6个区域设计4条特殊引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右温度下，启动循环链置换反应，完成对目标DNA的大量扩增。在LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区，启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，然后以此结构作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。

1.2 LAMP引物设计 首先在靶基因的3'末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5'末端设定B1、B2、B3三个区段。针对这六个区段设计四条引物，包括一对内部引物和一对外部引物。上游内部引物FIP：在3'末端含有与F2c互补的F2区段，在5'末端含有与F1c相同序列的区段下游内部引物BIP：在3'末端含有与B2c互补的B2区段，在5'末端含有与B1c相同序列的区段。上游外部引物F3：含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。下游外部引物B3：含有与目标DNA的B3相同序列的区段，各引物组成及对应区域如下图1所示。

[图1 LAMP的引物组成及对应区域]

引物的设计要注意以下几个问题：①扩增领域为F2～B2区段间，应该在200bp以内；②包含F2/B2在内的环状部分的长度在40～60bp范围内；③各区段的Tm值应该在60～65℃之间；④若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1～B1的间距可以为零；⑤引物应避免二次结构发生；⑥各引物的3'端不可含有与其他引物互补的序列。

1.3 LAMP技术特点 LAMP技术特点具有以下特点：①操作简便、耗时短、成本低，扩增反应在等温下持续进行，只需在恒温水浴锅中几十分钟即可完成，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，适合在基层养殖场的推广应用；②扩增的效率高，没有PCR反应中温模板的退火、复性过程，在15～60min内可扩增109～1010倍，能满足临床病料样本快速检测的需要；③特异性高，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。针对六个区段使用四种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列；④灵敏度高，检测的敏感性是常规PCR的10倍，扩增模板可达10拷贝或更少；⑤仅使用一种链置换型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一种不耐热的DNA聚合酶，因此必须在模板预变性以后再加样；⑥扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构；⑦当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。

1.4 反应产物的检测 LAMP反应产物的检测方法主要有五种：①以2%的琼脂糖凝胶电泳观察是否有典型的梯状条带泳判定结果；②以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生用肉眼直接判断扩增反应是否进行；③反应体系中加入溴化乙锭、SYBR Green Ⅰ等染料，通过观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的片段扩增；④通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果；⑤运用实时浊度仪监测反应结果。

2 在鸭病毒病检测中的应用

2.1 鸭病毒性肝炎病毒检测 鸭病毒性肝炎是由鸭病毒性肝炎病毒（DHV）引起的一种急性、高度致死性传染病。主要危害1～3周龄雏鸭，死亡率高达90%～95%，给养鸭业带来巨大的经济损失。该病于1945年首次在美国发现，随后相继在世界多数国家报道了该病的流行。DHV可分为I型、Ⅱ型和Ⅲ型3种血清型，其中I型（DHV-Ⅰ）为临床上常发的血清型。谢丽基等[4]根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列，设计特异性LAMP引物，建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg，高于常规PCR方法100倍，全部反应可在1h内完成，可以通过肉眼观察颜色直接判定结果，对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。胡成等[5]根据GenBank中登录的DHV-I VPl基因的高度保守序列，设计了特异性的引物，建立了一种灵敏、特异、高效的可视化体外环介导等温扩增方法。结果表明，该方法的灵敏性可达到10fg，是常规一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反应可以在1.0～1.5h内完成，并可以直接通过肉眼观察颇色进行结果判定，该方法对其他鸭常见的病原体检测结果全部为阴性。

2.2 鸭坦布苏病毒检测 鸭坦布苏病毒（DTMUV）可引起鸭的坦布苏病，感染鸭群的发病率高达100%，死亡率在5%～15%，临床表现为高热、蛋鸭产蛋率严重下降、部分感染鸭拉绿色稀便并出现神经症状，病理剖检主要表现为卵巢充血、出血、萎缩、坏死，卵泡破裂，心内膜出血，脾脏肿大，该病给养鸭业造成的经济损失达数十亿元[6]。张伟等[7]参考NCBI中已收录的DTMUV E基因保守区域设计了6条引物，通过对反应体系中各组分和条件进行优化，建立了DTMUV LAMP检测体系，并应用荧光显色剂（SYBR GreenⅠ和钙黄绿素、锰离子）对扩增产物进行可视化判定。结果显示，以SYBR GreenⅠ为染料，显色敏感性为10copies/μl的病毒，比普通PCR高100倍，以钙黄绿素和锰离子组合作为显色剂，其显色极限为1000copies/μl的病毒，虽低于SYBR GreenⅠ的显色敏感性，但能有效地避免气溶胶造成的空气环境污染。董嘉文等[8]根据DTMUV E基因保守区域设计了一套引物，建立了检测DTMUV的RT-LAMP方法，该法的最低检测限可达7.8copies，其灵敏度是普通RT-PCR的100倍，对其它常见鸭源病毒核酸扩增结果均为阴性。

2.3 鸭瘟病毒检测 鸭瘟是由鸭瘟病毒（DPV）引起的鸭、鹅等水禽的败血性、高度致死性传染病，其特征为两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大。是危害养鸭业最严重的传染病之一[9]，是OIE规定的B类传染病，给世界各国养鸭业造成了较大经济损失。许宗丽等[10]根据Gen Bank中DPV UI6基因的保守序列设计一套特异性引物，并对反应条件进行优化，建立DPV的LAMP可视化检测方法。结果：建立的LAMP方法对其他鸭常见病原体无扩增反应，可通过肉眼观察颜色直接判定结果，敏感性可达0.1fg，是常规PCR方法的100倍，扩增反应只须在常规水浴锅中进行，可在1h内完成。张坤等[11]根据GenBank中登录的DPV基因组序列，设计3对特异性的LAMP引物，经优化反应体系，建立了LAMP快速检测方法。结果表明，LAMP方法能够在63℃恒温下，1h内实现目的核酸的大量扩增。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法敏感性可达0.245μg/L，比普通PCR灵敏性高10倍，对DHV、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应。

2.4 鸭流感病毒检测 禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的禽类一种急性、高度接触性传染病。主要侵害禽类的呼吸系统、神经系统及消化系统等。AIV根据糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同分为16个HA亚型和10个NA亚型[12]，理论上可形成160种不同的禽流感病毒亚型，且不同亚型的病毒基因组会发生片段重组，造成病毒变异。王辰雨等[13]参考AIV 基质蛋白（M）基因设计了两对引物，特异性识别其6个不同位点，建立了基于颜色判定的LAMP方法。试验对不同禽源病毒进行了测试，结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒（H9和H5亚型）核酸，对AIV病毒的检测极限为10EID50。石霖等[14]针对AIV M基因设计了4个不同区段的特异性引物，并对反应条件和反应体系进行优化，建立了AIV的RT-LAMP方法。结果表明，该方法对AIV H1～H16亚型的检测结果均为阳性，而对其他禽类病毒的扩增均为阴性，具有良好的特异性。对AIV的最低检测限为13.43EID50/ml，灵敏度为普通一步RT-PCR的10倍，扩增反应可以在恒温水浴内60min内完成，在反应体系中添加荧光染料后，肉眼即可判定检测结果。该检测方法与RT-PCR方法和荧光定量RT-PCR方法对临床样品检测的符合率均为81.8%。

2.5 鸭细小病毒检测 番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒（MPV）引起急性传染病。该病主要危害3周龄内雏番鸭，病鸭临床表现为张口呼吸、喘气，消瘦、拒食、蹲伏，病例表现为十二指肠内容物呈松散栓子状，表层有脱落的粘膜附着，胰脏呈点状坏死，死亡率可达80%以上[15]，是目前番鸭饲养业中危害最严重的传染病之一。谢丽基等[16]根据GenBank登录的MDPV基因的保守序列，设计一套特异性LAMP引物，建立了MDPV的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg，高于常规PCR方法10倍，全部反应可在1h内完成，可通过肉眼观察颜色直接判定结果，对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。

2.6 鸭新城疫病毒检测 新城疫是一种由新城疫病毒引起的急性、高度传染性病，是禽类养殖中的重要疫病之一，在世界各地广发流行，各日龄鸭均可感染新城疫病毒发病，雏鸭最为严重，死亡率可达100%，给养鸭业带来了巨大的经济损失.鞠小军等[17]选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列，利用Primer Explorer V4在线软件设计了3对RT-LAMP引物，建立鸭源新城疫病毒RT-LAMP快速检测方法。结果显示，该法能够在63℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增，反应结果可直接用肉眼判断，特异性强，灵敏度高，与其他病毒，如H9N2亚型AIV、鸭呼肠孤病毒（DRV）、禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒等的核酸无交叉反应，可检测到1×10-3稀释度的目标RNA（0.1pg/μl），较普通RT-PCR的灵敏性高10倍。

2.7 鸭圆环病毒检测 鸭圆环病毒（DuCV）是近年来新发现的病毒之一，2003年由德国学者 Hattermann等[18]首先发现并报道。鸭感染DuCV的主要临床表现为生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，更重要的是可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制[19-20]。赵光远等[21]根据GenBank中DuCV基因序列，在保守区设计了6条特异性引物，并对反应条件进行优化，建立了一种适用于DuCV的LAMP检测方法。该方法对H9亚型AIV、小鹅瘟、DPV、DHV、鸭副黏病毒均无扩增反应，且扩增反应只需在常规水浴锅中进行，1h内即可完成反应，对DuCV模版DNA的最小检测限为10fg，灵敏度是一步法PCR的1000倍。

2.8 鸭呼肠孤病毒检测 引起鸭发病的呼肠孤病毒有新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV），鸭感染后主要临床表现为软脚、腹泻等，有的能够引起高达98%的死亡率，病理变化则主要以肝、脾灰白色局灶性坏死为特征[22]。马利等[23]建立了一种基于荧光显色的禽呼肠孤病毒LAMP检测方法。该检测方法使用针对禽呼肠孤病毒的p10基因8个区域的6条LAMP引物，能够在63℃恒温条件下1h内完成反应，具有良好的敏感性和特异性，最低能够检出102个拷贝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而对其他病毒检测结果为阴性。在荧光显色中分别应用SYBR GreenⅠ和钙黄绿素作为显色剂，其结果与琼脂糖凝胶电泳一致。于可响等[24]建立适于基层实验室快速检测NDRV的一步RT-LAMP方法。基于新型鸭呼肠孤病毒S3基因的6个保守区域设计了4条LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒温保持45min即可完成反转录和扩增反应，由此建立了RT-LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性，除NDRV外对其他6种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对病毒RNA的最低检出量为0.1pg，是常规RT-PCR方法的100倍。

3 在鸭细菌病检测中的应用

3.1 鸭疫里默氏杆菌检测 鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等。该病主要侵害鸭等水禽类动物，临床表现主要为神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎，2～7周龄雏鸭受到的危害最严重，发病率可达90%以上，死亡率高达75%以上，给养鸭造成了严重的经济损失[25]。吴彤等[26]根据鸭疫里默氏菌16Sr RNA基因设计引物，在建立了检测鸭疫里默氏菌的LAMP方法，该法在63℃ 60min即能完成反应，通过监测反应液浊度判断结果。在此基础上，用煮沸10min的方法代替试剂盒提取DNA方法，并用显色方法代替浊度检测和琼脂糖凝电泳方法判断结果，通过敏感性、特异性、病原消长规律试验验证方法的准确性。结果显示，显色法、浊度检测和琼脂糖凝电泳方法判断结果的敏感性和特异性相同。细菌分离法共获得201株鸭疫里默氏菌，且经LAMP与PCR法检测均呈阳性，LAMP与PCR法检出阳性样本总数分别为271份和254份，LAMP方法阳性检出率高于PCR方法。

3.2 禽多杀性巴氏杆菌检测 禽霍乱是一种由禽多杀性巴氏杆菌引起家禽和野禽发病死亡的接触性传染病，常表现为败血型，发病率和死亡率都很高，但有时表现为慢性经过。早在18世纪欧洲各地的禽类就常发生此病，目前该病在世界大多数国家都有分布，呈散发性或流行性，给养禽业造成巨大的经济损失，多年来一直都被国内外学者所重视，被列为重点防治的家禽疫病之一。施少华等[27]以禽多杀性巴氏杆菌C48-1为研究对象，利用LAMP方法对Pm进行快速检测，结果表明：LAMP方法在恒温65℃下，1h内就可以检测到Pm，LAMP方法最低可检测100pg.μl-1Pm基因组DNA。该方法不需要精密的温度循环装置，有恒温加热设备就可以满足检测条件，适合基层临床应用。

4 小结

LAMP技术作为一种快速基因扩增技术，自发明以来，在国内外疾病、卫生、食品及环境等多个领域都取得了重大成就，近年来受到了越来越多的关注，LAMP是整个过程均在恒温条件下进行，不需要昂重仪器设备，而易在基层部门普及的检测技术，避免了常规PCR对于温度循环的特殊要求所带来的各种不便，可快速、准确地做出传染性病病原学诊断，从而及时有效控制疫情，使养殖场损失降到最低。但LAMP检测技术同样存在一些不足，一是LAMP对于引物设计要求很高，需要设计的引物数目多，结构复杂；二是检测灵敏度太高，易因空气中的气溶胶污染而产生假阳性结果；三是在LAMP扩增结果判定方面也存在一定的问题，当以琼脂糖凝胶电泳法法判定结果时，结果为梯形条带，不易鉴别非特异性扩增。当焦磷酸镁白色沉淀和体系中添加染料法判定结果时，可能存在因结果颜色不明显而造成肉眼观察不便捷及误判，另外，当有非特异扩增时，染料也可结合，影响结果判定。当微流控芯片和实时浊度仪法判定结果时，则需要购置昂贵的分析仪器，随着研究的不断深入，研究人员还将其原位杂交、免疫捕获、核酸杂交等技术进行联合，开发了很多有效的检测方法，尤其是将环介导横温扩增与横向流动试纸条技术结合，发展起来的新的将环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）联合应用，建立一种新的病原快速检测技术，即LAMP-LFD技术。使得LAMP现场检测结果的观察更加方便、直观和准确。并解决了扩增产物形成气溶胶污染环境，导致样品间交叉污染的问题，开启了基因检测技术步入了基层养殖场的应用新时代，极具推广前景。目前已经有科研人员在CSFV的检测方面[28]进行了一些探索，并取得了一定的成绩，笔者认为这将是LAMP-LFD技术是未来LAMP检测技术将来的发展的方向，在一些基层实验室和流行病学调查等领域具有广阔的应用前景。

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