超声-微波协同萃取银杏叶黄酮与内酯B的工艺研究

吴昊，宗志敏，李秀秀

（1.徐州工业职业技术学院化学工程技术学院，江苏徐州221140；2.中国矿业大学化工工程学院，江苏徐州221116）

超声-微波协同萃取银杏叶黄酮与内酯B的工艺研究

吴昊1，2，宗志敏2，李秀秀1

（1.徐州工业职业技术学院化学工程技术学院，江苏徐州221140；2.中国矿业大学化工工程学院，江苏徐州221116）

研究了超声-微波协同萃取银杏叶黄酮与内酯B的最佳工艺条件，以银杏叶黄酮与内酯B得率为考核指标，探讨料液比、提取温度、乙醇体积分数以及浸提时间等因素对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响，并通过单因素及正交试验对其提取工艺条件进行了优化。结果表明，最优提取工艺条件为料液比1∶20(g∶mL)，提取温度50℃，乙醇体积分数为70%和提取时间4 min。在此最佳条件下，银杏叶黄酮及内酯B的得率分别为2.25%和0.81%。

银杏叶；黄酮；内酯B；超声波；微波；提取条件

银杏（Ginkgo bilobaL.）别名白果、公孙树，是中生代侏罗纪时期孑遗植物的稀有树种。银杏叶来源获取方便且是银杏树的有效活性部位，主要含有丰富的黄酮类化合物和萜内酯类等活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病及提高人体免疫能力等功效，银杏叶化合物已成为热门的天然产物活性物质研究之一[1-2]。

目前，对银杏叶活性成分的研究主要集中在某单个活性成分的提取、分离纯化及其功效研究等方面，而对于银杏叶中主要活性成分的同时提取研究较少[3-5]。当前银杏叶活性成分的提取主要有溶剂提取法、超声波法、微波法以及超临界流体萃取法。溶剂提取法的优点是操作简单、成本低。缺点是有机试剂容易造成环境的污染、且提取耗时长，效率低；超临界流体萃取的优点是提取效率高、收率大，缺点是设备昂贵、成本高且操作繁琐；超声波和微波法是分别利用机械波和电磁波破坏细胞壁结构，将活性成分充分溶出，因而花费时间短，不破坏活性成分，萃取高效，已被广泛应用于天然活性物质的提取、样品的预处理和污染物的清洗等方面[6-10]。唐仕荣[11]研究了微波-超声波协同萃取银杏黄酮工艺，将微波-超声波协同萃取方法作为一种原材料的预处理方法，考察了银杏黄酮这一类化合物组分的提取。

本研究旨在通过超声-微波协同工艺提取银杏中黄酮、萜内酯B的主要活性成分，考察料液比、提取温度、乙醇体积分数、提取时间对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响，优化超声波-微波协同萃取提取工艺，为银杏叶资源的综合利用研究提供试验依据，对银杏叶资源的综合利用开发研究具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

银杏叶：校园内采集；甲醇、磷酸（均为色谱级）：美国Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；槲皮素标准品（纯度＞98%）、山奈素标准品（纯度＞98.5%）、异鼠李素标准品（纯度＞98.5%）、银杏内酯B标准品（纯度＞98.5%）：中国药品生物制品鉴定所。

1.2仪器与设备

Essentia LC-15C高效液相色谱：岛津仪器（苏州）有限公司；ATY124电子天平：日本岛津公司；CW-2000超声波-微波协同萃取仪（超声波固定功率50W，频率40kHZ，微波功率可调）：上海新拓分析仪器科技有限公司；UV1901PCS紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；RV 10旋转蒸发仪：艾卡（广州）仪器设备有限公司；GL-20B高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1银杏叶的预处理

将银杏叶在50℃条件下烘干粉碎，过60目筛，加入一定体积分数的乙醇溶液浸泡24 h待用，以有利于后续的超声微波协同萃取。

1.3.2超声微波协同萃取工艺

在时间程序下设置微波功率为300 W，微波超声协同运行40 s（超声功率50 W及频率40 kHz），随后在恒温程序下设置一定的料液比、温度、乙醇体积分数、提取时间等因素条件超声微波协同萃取银杏叶黄酮与萜内酯B。

1.3.3银杏叶黄酮含量的测定

将预处理好的银杏叶，放置于萃取瓶内，加入乙醇溶液，设置一定的条件进行微波超声协同萃取，提取完毕后，于5 000 r/min条件下离心20 min，取上清液真空旋转蒸发浓缩至无液体流出，加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）的混合液25 mL，放置于水浴内加热回流30 min，而后冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45μm微滤膜过滤，取样待检，银杏叶黄酮含量的测定用高效液相色谱法[12]。色谱条件：Wondasil-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸（50∶50，V/V）；流速：1.0mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL；定量采用外标法。

1.3.4银杏内酯B含量的测定

银杏萜内酯类化合物主要有银杏内酯A、B、C、J和M，均为血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）拮抗剂，由于银杏内酯B对PAF产生的拮抗作用最强，因此本试验萜内酯类化合物选择以银杏内酯B为考察指标。

按1.3.2方法得到的粗提液取样真空浓缩，干燥粉碎，准确称量后分散于水中，并加入3倍体积的石油醚萃取，静置后分层，加入乙醇溶解，浓缩至干[13]。浓缩后物质加入乙酸乙酯，完全溶解后加入NaHCO3，调整pH 8～9，加入HCl调整pH至中性。振荡混匀后，静置分层，取上层溶液过滤，取样浓缩至无液体流出，加甲醇7mL超声溶解，定容至10mL，经0.45 μm微滤膜过滤，取样待检测，银杏内酯B含量测定用高效液相色谱法[14-15]。色谱条件：Wondasil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（35∶65， V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：28℃；进样量：10 μL；定量采用外标法。

1.3.5标准曲线的绘制

槲皮素、山奈素与异鼠李素：分别精确称取槲皮素标准品50 mg、山奈素标准品20 mg、异鼠李素标准品20 mg，分别置于100 mL棕色容量瓶中，加入部分甲醇超声溶解，再定容至刻度线，精密吸取对照品溶液适量，用甲醇分别制成质量浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08mg/mL、0.10 mg/mL的标准使用液。分别精密吸取各浓度对照溶液20 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。分别以槲皮素质量浓度、山奈素质量浓度、异鼠李素质量浓度为横坐标X（mg/mL），峰面积（mAU）为纵坐标Y，绘制标准曲线，得槲皮素线性回归方程为Y=0.011 9X+0.000 5，相关系数R=0.999 9；山奈素线性回归方程为Y=0.012 5X-0.000 1，相关系数R=0.999 9；异鼠李素线性回归方程为Y= 0.010 7X+0.000 3，相关系数R=0.999 9。

银杏内酯B：精密称取50 mg的内酯B标准品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，摇匀，分别精密移取2.5 mL、2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL标准液，分别转移至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，分别配制成质量浓度为2.5 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL标准品溶液。分别精密吸取各浓度对照溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以银杏内酯B质量浓度（mg/mL）为横坐标X，峰面积（mAU）为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=357.59X-3.491 3，相关系数R=0.999 9。

1.3.6提取条件优化单因素试验

称取10 g经预处理的银杏叶粉，按不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）），加入不同体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇溶液，在不同提取温度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃），不同提取时间1min、2min、3min、4 min、5 min条件下，分别考察料液比、乙醇体积分数、提取温度及提取时间对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响。

1.3.7提取条件优化正交试验

选定超声-微波协同萃取银杏黄酮和内酯B工艺中的料液比、提取温度、乙醇体积分数、提取时间作为考察的4个因素，每个因素各取3个水平，以银杏黄酮和内酯B的综合得率为评价指标，采用L9（34）正交设计进行试验，正交试验因素水平见表1。

表1　提取条件优化正交试验因素与水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.8银杏叶黄酮、银杏叶内酯B及综合得率的计算

总黄酮醇苷质量（mg）=[槲皮素质量（mg）+山奈素质量（mg）+异鼠李素质量（mg）]×2.51[16]

式中：2.51是中国药典总黄酮醇苷质量计算中的黄酮醇苷

与苷元之间的平均换算因子。

式中：C为测定样液的质量浓度，mg/mL；N为样品稀释倍数；V为样液浓缩体积，mL；W为样品质量，g。

权衡银杏叶中黄酮、内酯B两类物质对药理活性的贡献，设定银杏叶中黄酮、内酯B得率的权重分别为40%和60%，故综合得率（%）=银杏叶黄酮得率×40%＋银杏叶内酯B得率×60%。

2　结果与分析

2.1料液比对超声协同微波萃取银杏叶黄酮与内酯B得率的影响

图1　料液比对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由图1可以看出，料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）时，银杏叶黄酮与内酯B得率逐渐增加，并且黄酮的溶出速率高于内酯B，可能是因为银杏中黄酮的溶解性高于银杏内酯B；当料液比增加到1∶25（g∶mL）时，黄酮与内酯B得率即达到了较高值，当料液比＞1∶25（g∶mL）时，不仅得率没有明显增加，而且不利于后续的离心浓缩操作。因此，料液比为1∶25（g∶mL）为宜。

2.2提取温度对超声协同微波萃取银杏叶黄酮与内酯B得率的影响

由图2可以看出，提取温度分别在25～45℃及25～55℃时，随提取温度增大银杏叶黄酮与内酯B得率相应提高，这是因为提取温度越高，较高的温度促进活性物质分子的分子运动扩散，有利于银杏叶黄酮与内酯B的渗出。但在提取温度分别超过45℃及55℃之后，银杏叶黄酮与内酯B得率逐渐减小。可能是由于温度过高，超声-微波协同瞬间热效应过于明显，使得局部温度过高导致黄酮和内酯成分的破坏，从而影响了银杏叶黄酮和内酯B的得率；提取温度分别达到45℃、55℃时，银杏叶黄酮、银杏叶内酯B得率最高，由此可以得出黄酮对温度的敏感程度高于内酯B对温度的敏感程度。因此，提取温度50℃为宜。

图2　提取温度对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响Fig.2　Effect of extraction temperature on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.3乙醇体积分数对超声协同微波萃取银杏叶黄酮与内酯B得率的影响

图3　乙醇体积分数对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响Fig.3　Effect of ethanol content on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由图3可以看出，乙醇体积分数分别在40%～60%及40%～70%，随着乙醇体积分数的增加，银杏叶黄酮与内酯B得率逐渐增大；当乙醇体积分数分别为60%、70%时，银杏叶黄酮、银杏叶内酯B得率达到最大值；当乙醇体积分数分别高于60%、70%时，银杏叶黄酮、银杏叶内酯B得率逐渐降低。这与活性组分极性有关，由于银杏叶内酯B由倍半萜内酯和二萜内酯组成，极性相比较黄酮来说较小，因此容易被高体积分数乙醇溶剂浸提，低体积分数乙醇会导致活性组分不能完全溶出。因此，考虑到两种有效活性成分的提取，选60%为最佳的乙醇体积分数。

2.4提取时间对超声协同微波萃取银杏叶黄酮与内酯B得率的影响

由图4可以看出，提取时间在1～4 min内，银杏叶黄酮与内酯B的得率随提取时间的延长而增大，这是因为随着提取时间的增加，在超声波微波协同作用下，溶剂分子运动加快，不断促进银杏叶活性成分的溶出；当提取时间为4 min，银杏叶黄酮与内酯B的得率达到最大值；当提取时间＞4 min后，银杏叶黄酮与内酯B的得率出现下降趋势，一方面可能是因为乙醇溶剂的挥发造成浸提不充分，另一方面可能是超声波微波协同长时间的作用有可能造成活性成分的损失或破坏。因此，提取时间4 min为宜。

图4　提取时间对银杏叶黄酮与内酯B得率的影响Fig.4　Effect of extraction time on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.5提取条件优化正交试验

以银杏叶黄酮与内酯B综合得率为考察指标进行正交试验，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2　提取条件优化正交试验结果与分析Table 2　Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可以看出，各因素对银杏叶黄酮和内酯B综合得率的影响因素顺序为：提取温度＞料液比＞乙醇体积分数＞提取时间，提取条件的最佳组合为A1B2C3D2，即超声-微波协同提取银杏叶黄酮与内酯B的最优工艺条件为：料液比1∶20（g∶mL），提取温度50℃，乙醇体积分数70%和提取时间4 min。在此最佳条件下进行3次验证试验，银杏叶黄酮得率为2.25%，内酯B得率为0.81%。

由表3可知，对银杏叶黄酮与内酯B综合得率影响显著的是料液比和乙醇体积分数（P＜0.05）。提取温度对银杏叶黄酮与内酯B的影响极显著（P＜0.01）。

3　结论

超声-微波协同萃取银杏叶黄酮与内酯B的最佳工艺条件为：料液比1∶20（g∶mL），提取温度50℃，乙醇体积分数70%，提取时间4 min。在此最佳条件下，银杏叶黄酮得率为2.25%，内酯B得率为0.81%，综合得率为1.39%。超声-微波协同提取银杏叶黄酮与内酯B两种有效成分可以大大缩短提取时间，有效地提高了银杏叶黄酮和内酯B的得率，优于传统提取方法，是一种新型有效的提取方法，并为后续银杏叶黄酮与内酯B的分离奠定了基础。

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Extraction of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobaby ultrasonic wave and microwave synergistic technology

WU Hao1,2,ZONG Zhimin2,LI Xiuxiu1
(1.School of Chemical Engineering,Xuzhou College of Industrial Technology,Xuzhou 221140,China; 2.School of Chemical Engineering＆Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China)

The optimum extraction conditions of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobawere researched by ultrasonic wave and microwave synergistic technology.Using the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B as evaluation indexes,the effects of solid-liquid ratio,extraction temperature,ethanol content and extraction time on the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were discussed,and the extraction conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶20 (g∶ml),extraction temperature 50℃,ethanol content 70%and extraction time 4 min.Under the optimum conditions,the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were 2.25%and 0.81%,respectively.

Ginkgo biloba;flavonoids;ginkgolide B;ultrasonic wave;microwave;extraction conditions

R282.71

0254-5071（2016）10-0153-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.034

2016-09-13

徐州市生化资源综合利用与清洁生产重点实验室课题和校级课题（20550886599950）

吴昊（1980-），男，副教授，博士研究生，研究方向为生物活性物质提取及资源综合利用。