垃圾渗滤液浸种对玉米代际遗传效应的研究

李广科，陈俊艳

山西大学 环境与资源学院，太原 030006



垃圾渗滤液浸种对玉米代际遗传效应的研究

李广科*，陈俊艳

山西大学 环境与资源学院，太原 030006

采用实验室早期栽培实验，主要探讨了垃圾渗滤液浸种对玉米代际的遗传效应。结果表明：垃圾渗滤液会影响玉米代际早期的生长发育，低浓度垃圾渗滤液(10%)促进代际玉米种子的萌发及幼苗的生长；而高浓度渗滤液(50%)则对其产生抑制效应。再者，相比于经垃圾渗滤液浸种处理过的F1代玉米种子而言，对F2代产生的毒性效应相对减弱，仅高浓度组与对照组相比出现差异，50%处理组的萌发率、根长、芽长及叶绿素含量分别为对照组的81%，83%，79%和89%。此外，渗滤液浸种对代际玉米根尖细胞有丝分裂均表现出“低促高抑”的作用，对根尖微核损伤也均呈现剂量-效应关系。这说明低浓度垃圾渗滤液对玉米F1代及F2代的生态毒性风险依然存在，不容忽视。研究选用玉米为模式植物具有一定的实际意义，其结果可为垃圾渗滤液的生态风险评价提供理论依据。

垃圾渗滤液；玉米；遗传效应；浸种

玉米(Zea mays L.)是中国北方地区常见的主要农作物之一，由于其对大部分污染物具有敏感性而被选作为模式植物[11-12]。本实验以玉米为材料，拟通过研究不同浓度垃圾渗滤液浸种处理对玉米种子萌发的影响，探讨经渗滤液浸种处理后萌发的玉米幼苗对渗滤液胁迫的生理反应，比较不同浓度渗滤液浸种对玉米种子代际遗传效应的影响，以期为垃圾渗滤液的生态风险评价提供理论依据。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 垃圾渗滤液及种子的预处理

垃圾渗滤液采集于太原市侯村垃圾卫生填埋场，该填埋场属于北方高原山谷型垃圾填埋场，2007年投入使用，占地面积约59公顷，填埋区容积约为1.2×107m3，废物主要来源为城市生活垃圾。渗滤液样品采集于2015年1月，其具有北方冬季城市生活垃圾的代表性，基本理化性质如下：pH 8.25，电导率31.10 mS·cm-1，色度8 190倍，CODcr1 690 mg·L-1，氨氮838.82 mg·L-1，总氮1 520 mg·L-1，全盐量7 110 mg·L-1，总可溶性固体11 500 mg·L-1。收集的渗滤液贮存在4 ℃下备用。处理组含2%、10%、20%、30%、50% (V/V)的不同体积浓度，对照组为蒸馏水处理。不同水平的渗滤液应用在植物种子的浸种阶段。

玉米(F3×C237) (Zea mays L.)购买自山西省农业局，经过浸种处理后的F1代玉米种子种植于大田后任其自然生长，收获期得到F2代种子。收获的F2代种子与经过浸种处理的F1代种子进行相同的早期实验室研究，并进行比较。

1.2 萌发、根长及芽长

随机选取大小一致的处理过的F1代和收获得到的F2代玉米种子于铺有滤纸的培养皿内，用自来水培养，定时更换培养液，每次3～5 mL。以种子破白后根长约0.03 mm为萌发标准，记录第5 天时的种子萌发数，并用光学显微镜在15×40倍镜下测量长势大致相同的幼苗的根长及芽长。实验设3个平行，每组20粒种子。

1.3 叶绿素、丙二醛及活性氧

自萌发开始，玉米幼苗生长10 d后，剪取适量的新鲜叶片以测定其生理生化指标。叶绿素(Chl)采用丙酮-乙醇混合提取，分光光度法测定[13]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)加热比色法进行测定[14]；活性氧(ROS)水平的测定参照Yi等[15]描述的方法，于荧光指示剂2',7'-二氯荧光黄双乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)溶液中暗孵育30 min，荧光显微镜观察(激发波长488 nm)。

1.4 有丝分裂指数(MI)和微核率(MCN)

剪取玉米幼苗根尖，固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)固定24 h，70%乙醇中保存。Feulgen法染色后，切取染色后的根尖分生区约1 mm长，加盖玻片，常规压片，显微镜下观察并记录。每个处理组观察10株植物的幼根，约10 000个细胞。MI为各处理组根尖中分裂细胞占观察细胞的百分比，MCN为根尖细胞中的微核发生率，以千分比表示[16]。

1.5 数据处理

实验至少重复3次，以平均值±标准差表示。用Origin 7.0软件进行单因素方差分析及统计学多重比较，当P < 0.05时，认为差异显著；当P < 0.01时，认为差异非常显著；当P < 0.001时，认为差异极显著。

2 结果(Results)

2.1 渗滤液对玉米种子萌发率的影响

种子萌发是植物生命周期的起点，会直接影响幼苗的生长发育，因此，我们测定了垃圾渗滤液浸种对代际玉米种子萌发率的影响(图1)。结果显示：F1代玉米种子萌发率随浓度变化趋势显著，表现出“低浓度促进，高浓度抑制”作用。F2代种子萌发率变化趋势不明显，仅高浓度组与对照组相比出现差异，50%处理组的萌发率为对照组的81%。此外，F2代种子的萌发率在高浓度组与F1代相比中有显著差异(P < 0.05)。

2.2 渗滤液对幼苗根长、芽长的影响

幼苗期是植物生命周期的关键阶段，是对外界环境因子最敏感的时期之一，其幼苗的生长状况对植物整个生命期有重要影响，影响着最终生物产量及营养品质等[17]。图2为垃圾渗滤液浸种对代际玉米幼苗根长(A)及芽长(B)的影响。从图可以看出，F1代玉米幼苗的根长及芽长随渗滤液浓度的变化波动较大，表现出明显的“低促高抑”现象，10%处理组的根长及芽长分别为对照组的139%和108%，50%处理组的根长及芽长分别为对照组的52%和47%；而F2代玉米幼苗的根长、芽长随浓度变化趋势不大，仅在高浓度组(50%)与对照组有统计学差异(P0.05; P0.01)。

图1 渗滤液浸种对玉米代际萌发的影响注：不同处理组和对照组之间比较，* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001；F1代与F2代之间比较，# P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001。下同。Fig. 1 The effect of soaking with leachate on germination of inter-generational maizeNote: The comparison between different treatments and control, * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001; the comparison between F1 and F2, # P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001. The same below.

2.3 渗滤液对叶片生理生化指标的影响

植物叶片具有蒸腾作用，且外界污染物暴露会影响叶片生长、光合作用、新陈代谢等一系列生理活动，故植物叶片成为评定植物对外界污染物反应的主要部位之一[18]。图3 A表明垃圾渗滤液浸种对代际玉米叶绿素均表现出“低促高抑”的作用(图3A)。

图2 渗滤液浸种对玉米代际(A)根长、(B)芽长的影响Fig. 2 The effect of soaking with leachate on (A) root length and (B) shoot length of inter-generational maize

F1代“低促高抑”现象明显，低浓度组(10%)和高浓度组(50%)的叶绿素含量分别为对照组的133% (P0.05)和62% (P0.001)；F2代叶绿素含量随浓度变化不明显，仅在高浓度组(50%)与对照组出现差异(P0.05)。此外，丙二醛(MDA)含量和活性氧自由基(ROS)的变化趋势基本一致(图3B；3C)，低浓度下MDA和ROS含量均有所降低，而高浓度下MDA和ROS含量均有所升高。但总体而言，F1代随渗滤液浓度变化趋势明显，而F2代的变化趋势不明显。

2.4 渗滤液对玉米代际遗传毒性的影响

植物根尖细胞是分裂极旺盛的组织，是根中生命最活跃的部分，故可通过细胞染色体畸变、微核等手段检测样品的遗传毒性[19-20]。镜检结果显示，垃圾渗滤液浸种对代际玉米根尖细胞有丝分裂均表现出“低促高抑”的作用(图4 A)，F1代和F2代在低浓度下促进效应不明显，均无统计学差异，而在高浓度下呈现出浓度依赖性效应。具体来说，F1代在20%、30%、50%浓度组与对照组相比表现出显著的抑制效应(P0.01)，而F2代仅在30%、50%与对照组相比表现出统计学差异(P0.05)。此外，代际玉米根尖细胞微核率均呈现出剂量-效应关系，随渗滤液浓度的增加MCN逐渐升高(图4 B)。总体来说，F2代MCN变化趋势比F1代要弱，说明经大田种植生产后，垃圾渗滤液对玉米的遗传毒性仍然存在。

3 讨论(Discussion)

为探究垃圾渗滤液的遗传毒性，本实验以玉米为模式植物，采用渗滤液浸种方式探讨了其对玉米代际的遗传效应。结果表明，低浓度垃圾渗滤液的浸种前处理均促进F1代及F2代玉米种子的萌发及幼苗的根长、芽长，而高浓度的渗滤液反而会抑制其生长。这与我们之前的研究结果相吻合，分析其原因，垃圾渗滤液中含有植物生长所需要的营养元素，如氮、磷、钾、镁等会对植物的生长有一定的促进作用[21-23]，说明玉米可利用渗滤液中的微量元素，缓解来自低浓度渗滤液的压力并增强其对外界防御能力；此外，渗滤液作为一种成分复杂的高浓度有机污染物，浓度过高时污染成分就会超标，这些污染物进入植物根尖分生区干扰细胞内的正常生理代谢，同时渗滤液胁迫后细胞内核的结构也会发生改变[24]，使核处于固缩状态，影响细胞分裂及细胞周期，并影响基因转录、降低相关酶的合成或活性，从而使细胞代谢紊乱，进一步对植物造成损伤，抑制其生长。

图3 渗滤液浸种对玉米代际(A)叶绿素(Chl)、(B)丙二醛(MDA)及(C)活性氧自由基(ROS)的影响Fig. 3 The effect of soaking with leachate on (A) chlorophyll (Chl), (B) malondialdehyde (MDA), and (C) reactive oxygen species (ROS) levels of inter-generational maize

图4 渗滤液浸种对玉米代际(A)有丝分裂及(B)微核率的影响Fig. 4 The effect of soaking with leachate on (A) mitotic index (MI) and (B) micronucleus frequency (MCN) of inter-generational maize

此外，研究学者常利用叶绿素分析技术来评估植物的非破坏性效应[25]，而叶绿素含量又被证明与脂质过氧化作用有关[26]。逆境条件下，植物体内自由基产生和清除的平衡被打破，植物体内自由基大量积累，导致膜脂过氧化，破坏核酸结构，使蛋白质分解、酶丧失活性并损伤其他细胞的组分，从而影响植株的正常生长发育[27]。我们的结果表明，F1代及F2代玉米叶片的叶绿素含量与根长芽长的变化趋势基本一致。文献中报道，低浓度渗滤液中的营养元素参与叶绿素的合成，会对植物生长起关键作用[28]；而一旦浓度过高，其中的盐分或重金属离子等污染成分就会破坏植物中的色素，影响叶绿素合成酶的通路，改变酶的结构以及酶的活性和合成，导致叶绿素含量降低[29-30]。此外，高浓度渗滤液胁迫还会打破植物体内自由基的平衡，使植物体内富集大量自由基，导致膜脂过氧化，从而造成MDA和ROS含量的升高。

本研究对玉米代际遗传毒性的研究结果表明，尽管经垃圾渗滤液前处理的F1代玉米幼苗生长有明显的“低促高抑”现象，F2代玉米幼苗的生长状况总体来说有所改善，“低促高抑”现象不明显。这是由于经渗滤液处理过的F1代玉米种子经大田种植生产后，收获得到的F2代玉米种子对外界污染物的抵抗及耐受能力有所增强，从而减弱了高浓度渗滤液对种子萌发及幼苗生长的毒害作用。此外，垃圾渗滤液因其浓度不同对玉米根尖细胞有丝分裂表现出抑制或促进作用，说明渗滤液适当的浓度范围确实可以促进植物生长，但细胞微核率的结果提示，渗滤液同时也会造成染色体的断裂或损伤，增加微核发生率，其遗传毒性不容忽视。

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The Inter-generational Genetic Effect of Zea mays L. (Maize) Induced by Soaking with Landfill Leachate

Li Guangke*, Chen Junyan

College of Environmental Science and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

Received 31 March 2016 accepted 11 April 2016

The present research mainly investigated the generational genetic effect of the maize seed induced by soaking with landfill leachate by the method of the early cultivation experiment. The results showed that leachate with different levels (0%, 2%, 10%, 20%, 30%, 50%) affect the early growth and development of generational maize. Low concentrations (10%) of leachate promoted seed germination and seedling growth, while high concentrations (50%) showed restrained effects. Moreover, the toxicity effect on F2generation of maize was relatively weakened compared with the F1after seed soaking with leachate, and the significant differences of F2were only observed between high concentration group and control group. The germination rate, root length, shoot length and chlorophyll content of 50% treatment group were 81%, 83%, 79% and 89% of the control group, respectively. Furthermore, the influence of leachate on root tip mitotic index showed that low concentration promoted mitosis and high concentration suppressed it, while the micronucleus damage presented a dose-effect relationship. The results indicated the ecological risks of leachate on F1and F2generations of mazie still exist even at the low concentration. Our findings provided a certain practical significance by using Zea mays L. as model plant, and the results showed a theoretical basis for the ecological risk assessment of landfill leachate.

landfill leachate; Zea mays L.; seed soaking; genetic effect

国家自然科学基金(21477070)；高等学校博士学科点专项科研基金(20121401110003)

李广科(1971-)，男，博士，教授，研究方向为固体废弃物处理、处置及资源化，E-mail: liguangke@sxu.edu.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liguangke@sxu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160331009

2016-03-31 录用日期：2016-04-11

1673-5897(2016)4-108-06

X171.5

A

简介：李广科(1971—)，男，博士，教授，从事固体废弃物处理、处置及资源化研究。

李广科, 陈俊艳. 垃圾渗滤液浸种对玉米代际遗传效应的研究[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 108-113

Li G K, Chen J Y. The inter-generational genetic effect of Zea mays L. (maize) induced by soaking with landfill leachate [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 108-113 (in Chinese)